黑根霉RN-M246催化甾体的11α-羟基化培养基研究

胡曦予，崔 励，冯 魁

(大连工业大学轻工与化学工程学院，辽宁 大连 116034)

甾体类药物是仅次于抗生素的第二大类药物，随着需求量的不断增大，其合成技术也得到了越来越广泛和深入的研究[1]。甾体类药物的传统化学合成方法步骤繁琐、副产品多、产率低且环境污染严重，而微生物转化技术具有专一性强、产率高、条件温和、污染少等诸多优点，而且其转化反应类型十分丰富[2]，因此越来越受到重视。

雄甾-4-烯-3,17-二酮(Androst-4-ene-3,17-dione，AD)是制造甾体激素类药物的关键中间体，常用于制备孕激素、雄激素、皮质激素、避孕药等[3]，在甾体母核引入羟基，可使其抗炎活性大大增强。其11α-羟基化获得的11α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮是制备治疗高血压及充血性心力衰竭的新型药物的关键中间体，且临床疗效优于其它同类药物[4]。

作者采用微生物转化法，以黑根霉(Rhizopusnigricans)RN-M246催化底物雄甾-4-烯-3，17-二酮进行11α-羟基化反应，优化了发酵培养基，以使其有利于菌体生长及转化，拟为11α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮的工业化生产奠定基础。

1 实验

1.1 菌株与试剂

黑根霉RN-M246，清华大学生命科学院。

雄甾-4-烯-3,17-二酮，Sigma公司；其余试剂均为市售分析纯。

1.2 培养基

斜面培养基：小米培养基，pH值自然。

发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖30，玉米浆20，蚕蛹粉10，硫酸铵1，磷酸氢二钾5，pH值5.0。

1.3 方法

1.3.1 菌悬液的制备

黑根霉斜面中加适量无菌水，将孢子洗下，纱布过滤，充分振荡，制成1×107～1×108个·mL-1孢子悬液。

1.3.2 摇瓶转化

在500 mL挡板摇瓶中加入75 mL发酵培养基和10 mmol·L-1的底物，灭菌后超声，接入4%的菌悬液，在28 ℃、160 r·min-1条件下转化24 h，其后提高转速至220 r·min-1继续转化48 h。

1.3.3 HPLC分析

将发酵液高速离心，取上清液用甲醇稀释，稀释液经0.45 μm有机滤膜过滤，作为检测样品，进行HPLC分析。色谱条件：C18烷基硅烷键合反相柱；流动相为甲醇-水(3∶2，体积比)；流速0.8 mL·min-1；色谱柱温25 ℃；紫外检测器波长242 nm。

2 结果与讨论

2.1 碳源对转化反应的影响

碳源是培养基组成的重要成分之一，是菌体生长所需的重要营养物质，同时也影响着转化反应过程。固定发酵培养基中其它组分不变，分别考察不同碳源(30 g·L-1的葡萄糖、蔗糖、麦芽浸粉、可溶性淀粉、玉米淀粉、糊精、糖蜜)对转化率的影响，结果见图1。

图1 不同碳源对转化率的影响

由图1可知，葡萄糖与糊精作为培养基碳源时的转化率较高。其中，葡萄糖较易被微生物利用并转化成菌体生长所需的能量和碳成分，且价廉易得，广泛应用于微生物实验和工业化生产。因此，选用葡萄糖为最佳碳源。

2.2 速效有机氮源对转化反应的影响

速效有机氮源中丰富的营养物质能够快速而直接地被菌体吸收利用，使得菌体能在较短时间内生长，增加菌丝浓度。碳源为葡萄糖，固定发酵培养基中其它组分不变，分别考察不同速效有机氮源(20 g·L-1的蛋白胨、玉米浆、酵母浸粉、酵母浸膏、牛肉浸膏)对转化率的影响，结果见图2。

图2 不同速效有机氮源对转化率的影响

由图2可知，蛋白胨为速效有机氮源时的转化率最高，较原培养基中的玉米浆提高了8%。因此，选择蛋白胨为最佳速效有机氮源。

2.3 迟效氮源对转化反应的影响

黑根霉转化AD实验采用一步转化法，其发酵周期较长，在培养基中加入迟效氮源利于发酵后期营养物质的供给及代谢产物的形成。碳源为葡萄糖、速效有机氮源为蛋白胨，固定发酵培养基其它组分不变，考察不同迟效氮源(10 g·L-1的蚕蛹粉、冷榨豆粉、热榨豆粉、麸质粉、玉米蛋白粉)对转化率的影响，结果见图3。

图3 不同迟效氮源对转化率的影响

由图3可知，冷榨豆粉作为迟效氮源时的转化率最高，相对于原培养基转化率提高了5%。因此，选用冷榨豆粉为最佳迟效氮源。

2.4 无机氮源对转化反应的影响

碳源为葡萄糖、速效有机氮源为蛋白胨、迟效氮源为冷榨豆粉，固定发酵培养基其它组分不变，考察不同无机氮源(1 g·L-1的乙酸铵、硝酸铵、氯化铵、硫酸铵、柠檬酸三铵)对转化率的影响，结果见图4。

图4 不同无机氮源对转化率的影响

由图4可知，硫酸铵和柠檬酸三铵有助于转化率的提高。其中，添加硫酸铵的培养基所生长的菌体较易成团，导致转化率下降，而添加柠檬酸三铵的培养基所生长的菌体分散均匀，在较快的转速下仍不成团，保证了转化过程的顺利进行，其原因是柠檬酸三铵不仅提供了氮源，还起到了稳定和分散的作用。因此，选用柠檬酸三铵为最佳无机氮源。

2.5 pH值对转化反应的影响

pH值是影响菌体生长及转化过程的重要因素之一，不仅影响菌体的生长，同时也影响酶活性。在上述优化的发酵培养基条件下，考察发酵培养基的pH值对转化率的影响，结果见图5。

图5 pH值对转化率的影响

由图5可知，发酵培养基pH值为5.0时的转化率最高，达到48.4%，较原培养基转化率提高了约13%。因此，选用发酵最佳pH值为5.0。

3 结论

采用微生物转化法，以黑根霉RN-M246催化雄甾-4-烯-3,17-二酮11α-羟基化反应，考察了发酵培养基对转化率的影响。研究发现：常用作分散剂的柠檬酸三铵是菌体形态的主要影响因素，有效地改善了菌体易成团的现象，且菌量适中，均匀分散；蛋白胨含有较丰富的氨基酸等营养物质，作为速效有机氮源更有利于菌体在前期成长；而黑根霉的生长及转化时间较长，添加迟效氮源冷榨豆粉能够保证发酵后期营养的供给，使菌丝体持续生长并进行转化反应。

确定优化的发酵培养基(g·L-1)为：葡萄糖30、蛋白胨20、冷榨豆粉10、柠檬酸三铵1、磷酸氢二钾5、pH值5.0，在此条件下，可提高转化率约13%，最终转化率达48.4%。

[1] 郭一平，郑璞.甾体微生物C11α-羟化反应的研究进展[J].浙江工业大学学报，2004，32(4):437-441.

[2] 张丽青.微生物转化在甾体药物合成中的应用[J].中国医药工业杂志，1985,18(1):27-41.

[3] 杨英，姜绍通.微生物降解甾醇侧链转化雄甾-4-烯-3,17-二酮的研究进展[J].微生物学通报，2006,33(6)：142-145.

[4] Davis K L,Nappi J M.The cardiovascular effects of eplerenone,a selective aldosterone-receptor antagonist[J].Clinical Therapeutics，2003,25(11):2647-2668.