苯磺隆降解菌生长条件研究

王惟帅，吴济南，张天宝，杜慧玲

（山西农业大学文理学院，山西太谷030801）

苯磺隆（Tribenuron-methly）是一种内吸传导型磺酰脲类除草剂，于20世纪80年代由美国杜邦公司开发，具有高效、广谱、低残留、用量少等优点，是目前广泛用于麦田杂草防治的除草剂之一。苯磺隆曾被认为是一种易降解且在生态环境中无残留的农药[1-2]。然而，后来有研究发现，由于其对光、热稳定以及长期大量使用，给环境造成了土壤—水体—生物—大气各层面直接、复合交叉和循环式的立体污染，对农业生产和生态平衡造成不利影响[3]。利用微生物代谢多样性的特点对受污染土壤进行生物修复，是解决农药污染的重要途径[4-6]。目前，国内外关于苯磺隆的研究主要集中在药效、残留分析方法及其对植物生理特性的影响等方面[7-10]。而苯磺隆的生物降解以及苯磺隆降解菌生物学特性的研究鲜见报道[11-13]。山西农业大学农药学实验室从长期使用苯磺隆的污染土壤中，分离得到1株苯磺隆降解菌株，命名为BHL。本试验以其为研究对象，进行生长条件特性的研究，旨在为苯磺隆降解菌的实际应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试培养基 无机盐培养基（MM）组成为 ：MgSO4·7H2O 0.2 g/L；FeCl30.05 g/L；K2HPO41.0g/L；KH2PO41.0g/L；NaCl0.5g/L；CaCl20.02 g/L；NH4NO31.0 g/L；pH 值 7.0～7.5。

1.1.2 供试菌株和农药 苯磺隆降解菌株BHL由山西农业大学农药学实验室分离获得，苯磺隆原药（纯度95%）由中国沈阳化工研究所提供。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株生长量测定 降解菌株经无菌水洗涤2次后，接种于无机盐培养基（pH值7.0）中，使菌浓度达106个/mL，30℃，150 r/min振荡培养。定时取样，于OD600测定降解菌株BHL的生长情况。3次重复。

1.2.2 培养基初始pH值和Mg2+质量浓度对菌株BHL生长的影响 分别以初始pH值6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0 和 Mg2+质量浓度 100，200，300，400，500 mg/L为试验组，将含苯磺隆100 mg/L的无机盐培养基 （菌浓度大约达106个/mL）盛于250 mL三角瓶中，接种经活化24 h、磷酸缓冲液洗涤3次的降解菌株BHL后，30℃，150 r/min摇床振荡培养，同1.2.1定时测定菌体的生长量。每个试验设3次重复，并设置无菌为对照。

1.2.3 苯磺隆质量浓度和温度对菌株BHL生长的影响 活化24 h的降解菌株BHL经磷酸缓冲液洗涤3次后，接种于初始pH值为7.0，苯磺隆质量浓度分别为 50，100，200，300，400，500 mg/L的无机盐培养基中（菌浓度大约达106个/mL），30℃，150 r/min摇床振荡培养。测温度的试验组则将接种好菌株的含苯磺隆100 mg/L的无机盐培养基置于 10，20，30，40，50 ℃的条件下培养，同1.2.1定时测定菌体的生长量。每个试验设3次重复，同时设置无菌为对照。

1.2.4 通气量对菌株BHL生长的影响 采用250 mL三角瓶分别盛有含苯磺隆100 mg/L的无机盐培养基 20，30，50，70，90 mL，将活化 24 h 的降解菌株BHL经磷酸缓冲液洗涤3次后，接种于其中，于30℃，150 r/min摇床中振荡培养，定时测定菌体生长量，每个试验设3次重复，并设置无菌为对照。菌体生长量测定同1.2.1。

1.2.5 不同氮源、碳源对菌株BHL生长的影响

活化24 h的降解菌株BHL经磷酸缓冲液洗涤3次后，分别接种于以100 mg/L尿素、酵母膏、硝酸钠、苯磺隆等为唯一氮源和以葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和苯磺隆为唯一碳源的无机盐培养基中，且所选的氮源、碳源质量浓度均为100 mg/L（菌浓度大约达106个/mL），30℃，150 r/min摇床中振荡培养，定时测定菌体生长量，每试验3次重复，并设置无菌为对照。菌体生长量测定同1.2.1。

2 结果与分析

2.1 培养基初始pH值对降解菌株BHL生长的影响

从图1可以看出，在含有苯磺隆100 mg/L的无机盐培养基中，pH值在6.5～9.0范围内，菌株BHL均可以生长。不同时间的OD600值随着培养基初始pH的增加表现出先增加后减少的趋势；当pH值为7.0时，OD600最大，说明菌株在pH值为7.0时，生长最佳。

2.2 苯磺隆质量浓度对降解菌株BHL生长的影响

由图2可知，降解菌株BHL在苯磺隆质量浓度为50～500 mg/L时均可以生长。除50 mg/L外，其他质量浓度处理均在第7天时OD600值达最大；当苯磺隆浓度为100 mg/L时，不同时间的OD600值均为最大，说明菌株在苯磺隆质量浓度为100 mg/L时，生长最好。

2.3 温度对降解菌株BHL生长的影响

从图3可以看出，降解菌在所设的温度条件下均可以生长。随着温度的升高，OD600呈先增加后减少的变化趋势；当温度为30℃时，菌株长势最好。

2.4 通气量对降解菌株BHL生长的影响

由图4可知，在250 mL的三角瓶中装入20～90 mL培养液后，菌株BHL均可以生长，但随着培养基体积的增加，不同时间OD600呈先增加后减少的变化趋势。当装液量为50 mL（1/5体积）时，降解菌株BHL的生长最好。

2.5 Mg2+质量浓度对菌株BHL生长的影响

从图5可以看出，降解菌株BHL在供试Mg2+质量浓度范围内均可以生长。当Mg2+质量浓度为200 mg/L时，生长最佳。

2.6 不同氮源对降解菌株BHL生长的影响

由图6可知，降解菌株BHL在以尿素、酵母膏、硝酸钠和苯磺隆分别为唯一氮源的培养基中均可以生长，生长情况视不同氮源而异（酵母膏＞尿素＞苯磺隆＞硝酸钠）。从图6可以看出，以酵母膏为氮源时，降解菌株BHL的生长最好，OD600值明显高于其他几种氮源。苯磺隆作为唯一氮源时，菌株BHL可以生长，与以尿素、硝酸钠为氮源时生长状况差异不大。

2.7 不同碳源对菌株BHL生长的影响

从图7可以看出，以相同质量浓度的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和苯磺隆分别为唯一碳源的培养基中，以葡萄糖为碳源时，降解菌株生长情况较其他碳源要好。在所选碳源的培养基中，降解菌株虽都能生长，但生长情况较差，OD600值都在0.1以下。

3 讨论与结论

土壤中农药的降解途径，一般分为物理、化学与生物过程，而微生物降解与化学水解是其主要降解途径。土壤环境中存在多种可以降解农药的微生物。近年来，国内外研究者开展了生物强化修复农药的研究，通过富集培养、分离筛选等技术已经筛选出很多能够降解农药的微生物，应用微生物进行生物修复已成为环境修复的一个主要研究方向。生物修复技术主要是利用微生物的降解作用，将污染物分解并最终去除，它具有无毒、无残留、无2次污染等优点。而在修复过程中，外源降解菌的稳定性、活性等因素是影响生物修复的关键因素。因此，当引入外源降解菌对土壤进行生物修复时，只有了解降解菌的生物学特性，才能通过人为调控的手段来促进、强化生物修复，为提高农药的生物降解效率提供技术依据。有关磺酰脲类除草剂降解菌生长特性等方面的研究报道相对较少[14-15]。

本试验对从长期使用苯磺隆的田间土壤中分离得到的苯磺隆降解菌株生长条件优化研究表明，苯磺隆降解菌株BHL在pH值为6.5～9.0的范围内均可以生长，但以pH值为7.0时生长最佳；苯磺隆质量浓度对菌株BHL的生长有一定的影响，其质量浓度为100 mg/L时，菌株BHL生长最好；10～50℃范围内降解菌可以生长，但30℃时生长最好；250 mL三角瓶，装液量为20～90 mL菌株BHL均可以生长，但装液量为50 mL时菌株生长状况最好；Mg2+质量浓度为100～500 mg/L的范围内，菌株均可以生长，但当Mg2+质量浓度为200 mg/L时，菌株BHL的生长最佳。以100 mg/L尿素、酵母膏、硝酸钠、苯磺隆为唯一氮源和以100 mg/L葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和苯磺隆为唯一碳源的无机盐培养基中，菌株BHL均可以生长，其中，分别以酵母膏为碳源和以葡萄糖为氮源时，生长最好；且以苯磺隆为唯一氮源或碳源菌株都能够正常生长。

苯磺隆降解菌生长特性的研究，为利用生物手段修复苯磺隆污染土壤的研究提供了理论基础，同时为生产实践中的应用提供了技术支撑。

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