藜芦活性物质的提取及其抑菌效果研究

田慧霞，成 莉，薛文娟，高 斌，张椰莉，郭生金

（晋中学院生物科学与技术学院，山西晋中030600）

藜芦（Veratrum nigrum L.）又称山葱，属于百合科（Liliaceae）藜芦属（Veratrum L.）多年生草本植物。藜芦属植物约有40 余种，主要分布于亚、欧和北美洲，在我国广泛分布于山西、河南、四川等地，生于海拔1 500～3 000 m 的山坡或山谷[1]。该属多种植物可供药用，然而许多品种具有毒性，有的甚至具大毒，具有抗真菌和杀死稻蝗[2]等农业害虫的能力。藜芦味苦，性寒。中医认为，藜芦有涌吐风痰、杀虫疗疮的功效，主要用于治疗高血压、中风、疟疾、骨折等疾病[3-4]。藜芦全株有毒，毒素主要为藜芦甾体生物碱[5]，藜芦的中毒主要是急性中毒，如家畜食藜芦后半小时至数小时后出现大量流涎和持续呕吐、呻吟不安、腹胀、腹痛、腹泻、频频排尿，后期为全身衰竭、抽搐，瞳孔散大，血压和体温下降，昏睡甚至昏迷，最后因呼吸衰竭而死。因而，其被广泛应用于农业方面的杀虫、抑菌等研究[6]。

藜芦有抗真菌的作用，其水浸剂（1∶4）在试管内对堇色毛癣菌、同心性毛癣菌、铁锈色小芽胞癣菌、腹股沟表皮癣菌等皮肤真菌都有不同程度的抑制作用[5]。藜芦对结核菌也有较强抑制作用[7]，其乳膏有明显的体外杀螨作用[8]，并可治疗疥疮[9]。但是，关于藜芦中活性物质抑菌效果的研究较少。

本试验就藜芦活性物的提取及其抑菌效果进行初步研究，通过测定藜芦活性物质抑制细菌的作用，为其应用于新型植物源农药的开发提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验材料 藜芦（Veratrum nigrum L.）采自吕梁市庞泉沟，经查阅《中国植物志》[10]鉴定其为黑藜芦。

1.1.2 主要仪器和器具 脂肪提取器；250 mL圆底烧瓶；MH-500 型调温型电热套，北京科伟永兴仪器有限公司；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；DZKW-4 型电子恒温水浴锅，北京中兴伟业仪器有限公司；HZS-H 型水浴振荡器，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；SB-JS-1 型洁净工作台，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；GMSX-280 手提式压力蒸汽消毒器，北京市永光明医疗仪器厂；DHX-9143B 型电热恒温鼓风干燥箱，上海福玛试验设备有限公司；培养皿；牛津杯（内径6 mm，外径8 mm）；移液管（1 mL）；涂布棒；注射器；酒精灯。

1.1.3 使用试剂 95%乙醇水溶液，2%H2SO4溶液，石油醚，氨水，二氯甲烷（CH2Cl2）。

1.1.4 供试细菌 大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）均由山西大学生命科学院微生物实验室提供。

1.1.5 试验所用培养基和无菌生理盐水 牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15～20 g，自来水1 000 mL，pH 值为7.2～7.4；牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，自来水1 000 mL，pH值为7.2～7.4；无菌生理盐水为0.85 g NaCl 溶解于蒸馏水，再经高压灭菌所制。

1.2 方法

1.2.1 藜芦活性物质的提取方法

1.2.1.1 藜芦活性物质的粗提取 取藜芦根和茎，在恒温鼓风干燥箱中烘干，粉碎后，称量12 g包在预先准备好的滤纸包里，用200 mL 95%乙醇水溶液于100 ℃水浴中热回流提取2.5 h。

1.2.1.2 藜芦活性物质的分离与纯化 粗提取的藜芦成分由SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵抽滤，去渣后，经减压蒸馏蒸出乙醇（0.07 MPa，40 ℃），浓缩成浸膏状物质。然后用2%H2SO4溶液酸化藜芦提取物（调pH 值至3.5），用石油醚进行脱色处理（脱色5～6 次），再用氨水调节脱色后的藜芦提取物pH 值至9～10，用二氯甲烷萃取出藜芦活性物质，最后再蒸馏出二氯甲烷（101 kPa，40～50 ℃），得到纯化的藜芦活性物质。

1.2.2 藜芦活性物质对3 种细菌的抑菌试验

1.2.2.1 藜芦活性物质溶液的配制 将经二氯甲烷萃取出的藜芦活性物质称质量后，再溶解于一定量的二氯甲烷（已知二氯甲烷无抑菌作用）中，并由二氯甲烷稀释成质量浓度分别为0.48，0.38，0.28，0.18，0.08，0.05 g/mL 的藜芦活性物质溶液，供抑菌试验用。

1.2.2.2 细菌的培养与接种 预先制备牛肉膏蛋白胨固体、液体培养基和无菌生理盐水。先将细菌接种到已灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，放置于恒温箱中37 ℃下培养24 h。然后将预先融化的无菌牛肉膏蛋白胨固体培养基，倒入培养皿中（每皿盛12～15 mL 培养基），制成平板培养基。再将3 种细菌于无菌生理盐水中稀释100 倍制成菌悬液，在无菌操作条件下，用涂布法接种到平板培养基中，供抑菌试验用。

1.2.2.3 藜芦活性物质抑菌试验 取经灭菌的牛津杯放置于已接种3 种细菌的平板培养基中（每皿放置4 个牛津杯），用注射器量取由二氯甲烷稀释为不同浓度梯度的藜芦活性物质，并注射于牛津杯中（15 滴/ 杯），放置于恒温培养箱37 ℃下培养24 h 后，观察并测量抑菌圈大小。每种浓度的藜芦活性物质分别对3 种细菌各进行3次抑菌试验，以蒸馏水为对照组。

2 结果与分析

2.1 抑菌圈大小

从图1 可以看出，藜芦活性物质在0.05～0.48 g/mL 范围内，对3 种细菌都有一定的抑制作用，而且抑菌作用随着藜芦活性物质浓度的增加而增大，其中，对枯草芽孢杆菌的抑制作用比较明显（图1-C）。

从表1 可以看出，藜芦活性物质的抑菌效果与其浓度呈正相关关系。当藜芦活性物质的质量浓度为0.38～0.48 g/mL 时，藜芦活性物质的抑菌效果良好，抑菌圈直径在18～23 mm 之间。以蒸馏水作为对照，所做的抑菌试验结果如图1-D所示。结果表明，蒸馏水对细菌没有任何的抑制作用。

表1 藜芦活性物质对3种细菌的抑菌效果 mm

2.2 最小抑菌浓度

将藜芦活性物质稀释成更小浓度，采用牛津杯法，对3 种细菌进行抑菌试验，测定能够抑制细菌生长的藜芦活性物质的最小质量浓度。结果表明，当藜芦活性物质的质量浓度小于0.08 g/mL时，对3 种细菌几乎没有抑制作用（图2）。这说明能够抑制细菌生长的藜芦活性物质的最小质量浓度为0.08 g/mL。

3 结论与讨论

3.1 藜芦活性物质抑制细菌生长最小质量浓度

藜芦活性物质由二氯甲烷稀释到0.08 g/mL时，抑菌效果不明显；当质量浓度小于0.08 g/mL时，无抑菌效果，说明能够抑制细菌生长的藜芦活性物质的最小质量浓度为0.08 g/mL。

3.2 藜芦活性物质抑制细菌生长的最适浓度

藜芦活性物质由二氯甲烷稀释到0.38 g/mL时，抑菌效果较好；当质量浓度大于0.38 g/mL 时，抑菌圈大小基本无变化，说明能够抑制细菌生长的藜芦活性物质的最适质量浓度为0.38 g/mL。

3.3 藜芦活性物质可抑制细菌生长

一定浓度的藜芦活性物质对细菌有毒杀作用，能够抑制细菌生长。

［1］史志诚.中国草地重要有毒植物[M].北京：中国农业出版社，1997.

［2］任竹梅. 藜芦和苦参对中华稻蝗的毒力 [J]. 动物学报，2001，47（S1）：48-51.

［3］徐暾海，徐雅红.藜芦属植物化学成分和药理[J].国外医药：植物药分册，2002，17（5）：185-189.

［4］徐国钧，徐珞珊，王峥涛.常用中药材品种整理和质量研究（第4 册）[M].福建：福建科学技术出版社，2001：121-178.

［5］赵瑜，陆国才.藜芦生物碱药理和毒理学研究进展[J].中药新药与临床药理，2008，19（3）：240-242.

［6］刘海峰.有毒植物提取的生物碱杀虫活性[J].安徽农业科学，2010，38（36）：20645-20648.

［7］毛晓峰，史志诚，王亚洲.我国藜芦属植物研究进展[J].动物毒物学，2003，18（1/2）：17-21.

［8］郑善子，崔春权，刘永镇.藜芦乳膏对毛囊蠕形螨的体外杀虫作用[J].延边大学医学学报，2004，27（1）：31-32.

［9］杨素华，李东宁，孙健.藜芦乳膏治疗疥疮的疗效观察[J].辽宁中医杂志，2004，29（11）：664-666.

［10］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社，1980.