皂荚抗肝癌细胞成分的初步研究

张振宇 张晓丽 程红球

（1.汕头大学医学院第二附属医院，广东 汕头 515041；2广东省深圳市第二人民医院，广东 深圳 518035）

皂荚为豆科植物皂荚的果实，味咸，性温，无毒，是中医治疗乳腺癌、肺癌、肝癌等多种癌症常用的配伍药之一，被列为抗癌中草药。2005年6月，香港理工大学与美国国立癌症研究所研究发现［1-2］，皂荚的浓缩液具有抗癌特性，可有效地抑制血癌及多种人类固体肿瘤，包括乳腺癌、肝癌和前列腺癌等癌细胞的生长，但其作用的物质基础不明。本实验主要通过逐级提纯皂荚研究其对肝癌细胞的作用机制，并为进一步分析其作用成分提供基础。

1 材料与方法

1.1 细胞株人肝癌细胞bel-7402，由上海细胞生物学研究所陈瑞铭1978年建株，购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。

1.2 药物皂荚由湖北省药材公司提供，皂荚提取液由湖北中医学院药学院制作提供，皂荚生药质量浓度为1 g/mL。

1.3 试剂及仪器bax单抗、bcl-2单抗、P53单抗、超敏S-P（鼠）即用型免疫试剂盒、DAB显色剂、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、TIANamp Genmic血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒、PCR-ELISA端粒酶试剂盒均由福建迈新公司提供，RPMI-1640培养液、DMSO、小牛血清、MTT等均由晶美公司提供。流式细胞仪（美国COUITER公司，EPICSELTE ESP型），倒置相差显微镜 （日本OLYMPUS公司，LH50A型），电泳仪（CBS公司，MGU-102T），凝胶成像分析仪 （美国UVP公司，GDS8000型），液闪仪（美国BACKMAN COULTER公司，LS6500型），酶标仪器（美国Bio-Rad公司），净化工作台（苏州，SW-CJIF 型），CO2培养箱（美国 SHELDON 公司，TC2323型）。

1.4 分组随机分为对照组、皂荚提取物低、中、高剂量组（质量浓度分别为 0.05、0.1、0.2 mg/mL）。

1.5 细胞培养人肝癌细胞bel-7402接种于含10%小牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI-1640完全培养液中，在37℃、含5%CO2培养箱内培养，并用0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.6 MTT法检测药物对细胞生长的抑制情况将传代的人肝癌细胞bel-7402浓度调整为5×105/mL，接种于96孔培养板，每孔200 μL，共分4组，每组均设为6个平行孔，培养24 h至细胞生长旺盛后，去培养液，随机分为对照组，皂荚提取物低、中、高剂量组 （质量浓度分别为0.05、0.1、0.2 mg/mL）。 对照组不加药物，皂荚提取物各剂量组分别加药液180 μL并继续培养。48 h后，各孔再加入 MTT 贮液（5 mg/mL）20 μL，继续培养 3 h，吸弃上清液，每孔加入DMSO 200 μL，将培养板置于微孔振荡器上振荡10 min，溶解微小结晶，然后全自动酶标仪上选择波长490 nm检测各孔A值。计算细胞增殖抑制率=（1-实验组A值/对照组A值）×100%。

1.7 流式细胞仪检测各组细胞凋亡峰将bel-7402细胞分别培养在对照组（无药血清培养液）、皂荚提取物低、中、高剂量组（质量浓度分别为 0.05、0.1、0.2 mg/mL）培养液中，培养 72 h后收集各组细胞并制成1×106/mL的细胞悬液，1000 r/min离心5 min，弃上清液，PBS洗涤2次后再将细胞浓度调整为1×106/mL，以 70%的冷乙醇 （1∶4）固定待检，用 PBS洗去固定液，加RNaseA，37℃水浴30 min，再加PI染色液混匀，4℃避光30 min，在流式细胞仪上选择488 nm激发光检测各组细胞DNA含量，得出凋亡率。

1.8 检测凋亡相关基因表达免疫组化法检测bax、bcl-2、P53蛋白的表达。取对数生长期细胞bel-7402，调整细胞浓度为1×105/mL接种于内置无菌玻片24孔培养板（1mL/孔）。培养24 h后，分为对照组（不加药物），皂荚提取物低、中、高剂量组（质量浓度分别为0.05、0.1、0.2 mg/mL）。以上各组平行3孔，继续培养，48 h后爬片用PBS漂洗两遍，经4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤后自然风干，-20℃保存备用。检测方法按免疫组化试剂盒说明书进行。阳性细胞的特征为胞浆或胞核染为黄色或棕黄色，阴性细胞不染色。

1.9 端粒酶活性测定按端粒酶检测试剂盒说明书进行。即：将bel-7402细胞分别培养在对照组（无药血清培养液），皂荚提取物低、中、高剂量组（质量浓度分别为 0.05、0.1、0.2 mg/mL），培养72 h后收集各组细胞于1.5 mL Ep管，加入1×CHARPS裂解液200 μL，震荡悬浮细胞。冰浴包被30 min后，12000 r/min，4℃，离心20 min，吸取上清，即得到含有端粒酶的细胞提取物。在PCR管中加入 PCR 反应液（5×TARP反应液 10 μL、Taq酶 2U、双蒸水 37.6 μL、细胞提取物 2 μL），30 ℃，延伸扩增反应 30 min，然后进行PCR反应33个循环，每个循环包括94℃，30 s，55℃，30 s。将酶标板包被阻断稀释缓冲液两次后，加入TARP反应液5 μL，37 ℃孵育 60 min，洗涤，加入 anti-DAPAb 100 μL/孔室温包被30 min，洗涤，加入TMB反应液，室温包被3～10 min后，加入终止液100 μL/孔，在酶标仪上选择波长450 nm测定吸光度A值。计算抑制率=（1-实验组A值/对照组A值）×100%。

1.10 统计学处理应用SPSS10.0统计软件。数据采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 皂荚提取物对bel-7402细胞增殖的影响见表1。MTT法实验结果显示，皂荚提取物中、高剂量组对人肝癌细胞bel-7402增殖均具有显著的抑制作用 （P＜0.05），其中高剂量组对bel-7402细胞增殖的抑制作用具有非常显著的统计学意义 （P＜0.01）。

表1 各组bel-7402细胞增殖比较（±s）

表1 各组bel-7402细胞增殖比较（±s）

与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。 下同。

组 别 n A值 抑制率（%）对照组 6 1.721±0.031皂荚提取物低剂量组 6 1.556±0.023 9.31皂荚提取物中剂量组 6 1.502±0.017* 12.79皂荚提取物高剂量组 6 1.431±0.018** 16.86

2.2 皂荚提取物对bel-7402细胞周期的影响见表2。皂荚提取物低、中、高剂量组与对照组作用人肝癌bel-7402细胞72 h后，bel-7402细胞在G0～G1期的比例增高，S期的比例降低，与对照组比较差异非常显著（P＜0.01），在G0～G1期前可见凋亡峰。

表2 各组bel-7402细胞周期比较（%，±s）

表2 各组bel-7402细胞周期比较（%，±s）

组 别 n G0-G1对照组 3 27.30±1.11皂荚提取物低剂量组 3 36.96±1.98**皂荚提取物中剂量组 3 45.43±1.34**皂荚提取物高剂量组 3 49.75±2.97**S G2-M 70.93±2.41 1.77±0.21 62.57±1.02 0.47±0.08 50.27±1.31 2.30±0.41 41.95±1.43 3.63±0.73

2.3 皂荚提取物对bel-7402细胞凋亡基因的影响见表3。皂荚提取物低、中、高剂量组bcl-2表达显色与对照组比较无显著差异，bax、P53表达显色较对照组明显加深，差异有统计学意义（P＜0.05 或 0.01），且皂荚提取物低、中、高剂量组组间 bax、P53蛋白表达无显著差异。

表 3 各组 P53、bax、bcl-2 表达比较（%，±s）

表 3 各组 P53、bax、bcl-2 表达比较（%，±s）

组 别 n P53阳性细胞率对照组 3 24.50±6.04皂荚提取物低剂量组 3 26.13±0.47*皂荚提取物中剂量组 3 34.97±2.34**皂荚提取物高剂量组 3 38.50±0.53**bax阳性细胞率 bcl-2阳性细胞率21.03±2.57 41.27±2.14 27.80±1.21** 39.18±1.52 34.61±0.54** 37.23±1.16 40.33±0.52** 36.73±2.79

2.4 皂荚提取物对bel-7402细胞端粒酶活性的影响见表4。与对照组比较，皂荚提取物低、中、高剂量组显著下降（P＜0.05或0.01），表明皂荚提取物各剂量血清均可抑制bel-7402细胞端粒酶活性，其中皂荚提取物高剂量组对bel-7402细胞端粒酶活性的抑制具有非常显著的作用（P＜0.01），

表4 各组bel-7402端粒酶的活性比较（±s）

表4 各组bel-7402端粒酶的活性比较（±s）

组 别 n 端粒酶活性（A450） 抑制率（%）对照组 6 0.935±0.049皂荚提取物低剂量组 6 0.672±0.076* 28.7皂荚提取物中剂量组 6 0.632±0.035* 32.9皂荚提取物高剂量组 6 0.562±0.056** 40.4

3 讨 论

肝癌的发生机制大致认为是致癌因素导致染色体畸变 （错位、倒转、断裂、插入、重排等）、癌基因的激活、生长因子及其受体的异常、抑癌基因的失活等，导致肝细胞的遗传学特征发生改变，最终形成肝癌细胞。肝细胞癌变包括基因突变与基因调控失常两种理论解释。人肝癌细胞的生长受凋亡抑制基因与凋亡促进基因的调控。bax、bcl-2均可彼此形成异二聚体或与自身形成同源二聚体，其抑制或促进凋亡主要取决两者的比例。当bax蛋白或蛋白二聚体占优势时，细胞凋亡可被诱导；当bcl-2蛋白或蛋白二聚体占优势时，细胞凋亡被抑制。P53则严密监控细胞内外的变化，一旦细胞受到攻击出现损伤，P53立即被激活，使受损伤的细胞停顿在G1期以便DNA得到修复，或指示其进入凋亡［2］。P53基因发生突变或者其功能失活后，细胞周期的调节失去一种具有抑制作用的调节因子，细胞程序性死亡的调节失去一种具有促进作用的调节因子，最终使细胞生长和调节失控，导致细胞持续分裂和癌变［3］。当细胞周期发生障碍时，细胞增殖将受到抑制，而DNA合成障碍是细胞周期发生障碍的较常见原因［4-5］。 另外，研究表明［6-7］，肿瘤细胞大多表达端粒酶活性增强，而细胞增殖周期的调控与端粒酶活化密切相关，端粒酶活化有可能是所有恶性肿瘤发生过程的一个必经之路，癌基因的激活和/或抑癌基因的失活最终导致端粒酶活化，从而导致细胞端粒的丢失与重新组合达到一种动态平衡，恶性肿瘤细胞得以无限繁殖［8］。

本实验显示，皂荚提取物对人肝癌细胞bel-7402的增殖具有显著抑制作用，能够诱导bel-7402细胞凋亡，抑制bel-7402细胞端粒酶活性，调控癌基因活化与抑癌基因失活，阻止肿瘤细胞的无限繁殖。与对照组比较，高剂量皂荚提取物对肿瘤细胞增殖的抑制作用更显著。本次研究的各个项目的数据结果并不完全一致，考虑可能与药物质量浓度的稳定性及纯度有一定关系。笔者推测皂荚提取物对肿瘤细胞的作用机制可能如下：抑制活化的端粒酶，阻止细胞DNA的无限繁殖；提升抑癌基因的活性，促进癌细胞的凋亡；可能作为一种信息物质，直接参与细胞凋亡活动，抑制肿瘤细胞DNA无限复制。

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