探讨纳米级中药黄芪对溃疡性结肠炎大鼠肠道菌群失调的调整作用

孙立群 梁金花 高月娟

（牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011）

溃疡性结肠炎（UC）为病因和发病机制尚不明确的大肠黏膜慢性非特异性炎症，是以腹泻、黏液脓血便、腹痛和里急后重为主要症状，以结肠黏膜慢性炎症和溃疡为病理特点的一种消化道疾病。近年来其发病率呈逐年上升趋势。临床常用柳氮磺胺吡啶（SASP）和糖皮质激素进行治疗，但副作用大且容易复发［1-2］。

本实验根据部分补益类中药具有扶植肠道正常菌群生长，调节菌群失调，提高定植抗力功能，可起到益生元作用的机理，选取纳米级黄芪作为治疗药物，从微生态学角度探讨其对UC大鼠肠道菌群失调的调整作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物Wistar大鼠60只，体质量 180～220 g，雌雄各半，由牡丹江医学院动物实验中心提供。

1.2 试剂乙酸﹑丙酸﹑丁酸﹑异丁酸标准品（美国Sigma公司），丽珠肠乐（珠海丽珠集团丽珠制药厂），培养基（青岛海博生物有限公司），2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）（Sigma 公司）。

1.3 纳米级黄芪（1）制备：将常态黄芪剪碎，60℃下24 h烘干，常规粉碎，加入适量蒸馏水，然后应用球磨机磨48 h进行纳米化，制成纳米中药，生药质量浓度为0.2 g/mL。4℃保存，给药前复温至25～30℃。（2）鉴定：将球磨法制备的中药稀释到一定浓度，超声分散，透射电镜观察，药物粒径在100 nm以下。

1.4 分组与造模60只大鼠随机分为模型组（10只），正常组（20 只），自然恢复组（10 只），丽珠肠乐组（10 只），纳米黄芪组（10只）。除正常组外，其余各组大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.2 mL/100 g）麻醉，固定。将外径2.0 mm、长约15 cm左右的输液管（输液管先用液体石蜡油润滑），从大鼠肛门逆行插入结肠内深约8.0 cm处，一次性将含100 mg/kg TNBS和50%乙醇的TNBS-乙醇液0.25 mL注入结肠内，用棉签堵住肛门，轻揉腹部1 min，使TNBS-乙醇液均匀地与结肠黏膜接触。然后将大鼠头向下，身体倾斜45°，放置1 min，再将大鼠放平。对照组采用同样方法，0.25 mL 0.9%氯化钠注射液灌肠，均自然清醒。3 d后，处死模型组大鼠和10只正常组大鼠，剪取直肠和结肠组织，清洗后肉眼观察结肠组织，并取肠段（10%甲醛溶液中固定）作组织切片以确定造模是否成功。

1.5 给药方法纳米黄芪组采用纳米黄芪进行灌胃治疗，丽珠肠乐组用丽珠肠乐灌胃治疗，自然恢复和正常组用0.9%氯化钠注射液灌胃，以上各组灌胃量均为每次0.3 mL，每日两次，连续7 d后处死进行指标检测。

1.6 标本采集与检测

1.6.1 肠道菌群检测 在距大鼠回盲部末端10 cm以内，无菌采取盲肠内容物0.1 g，用无菌0.9%氯化钠注射液进行10倍系列稀释至10～9倍。不同稀释度标本滴种培养48 h后进行菌落计数。

1.6.2 气象色谱分析技术检测脂肪酸含量 无菌条件下取0.05g盲肠内容物，立即放入无菌玻璃试管中，溶于1 mL蒸馏水中，加50%硫酸0.1 mL、乙醚0.5 mL，盖紧塞子，来回倒转20次，使乙醚和培养物充分混匀，1000 r/min离心10 min，置试管于-20℃冰箱至试管底部水结冰，迅速倒出乙醚于另一试管，取1 μL作色谱分析。将样本注入进样器后，仪器自动采集数据并送到1200工作站积分处理并作出色谱图，其中记录各有机酸的出峰顺序、保留时间、峰高、峰面积百分比。

1.6.3 肝脏细菌易位检测 将大鼠在无菌条件下取肝组织0.1 g，置于无菌匀浆器中，加0.9 mL 0.9%氯化钠注射液匀浆，将标本稀释至10-3，用微量加样器吸取标本20 μL滴种在中国兰培养基上，置于37℃温箱中培养24 h后进行菌落计数。

1.7 统计学处理应用SPSS16.0统计软件，数据采用（±s）表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 成模情况模型组肉眼观显示结肠黏膜充血、水肿、糜烂、出血、溃疡；显微镜下显示隐窝有急性炎细胞浸润，固有膜内有慢性炎细胞浸润。正常组大鼠结肠黏膜组织肉眼观和显微镜下均显示正常。

2.2 传统培养法检测肠道菌群的变化见表1。与正常组相比，模型组双歧杆菌和乳酸杆菌数量明显下降，肠杆菌和肠球菌数量显著上升，且差异具有统计学意义（P＜0.05）。纳米黄芪组与丽珠肠乐组双歧杆菌和乳酸杆菌的数量均明显上升，肠球菌和肠杆菌的数量明显下降，相比自然恢复组具有显著差异 （P＜0.05），纳米黄芪组与丽珠肠乐组之间的差异亦有统计学意义（P＜0.05），说明纳米黄芪对肠道微生态失调的调整作用优于丽珠肠乐。

表1 各组大鼠肠道菌群定量检测结果比较（lgN／g，±s）

表1 各组大鼠肠道菌群定量检测结果比较（lgN／g，±s）

与正常组比较，*P＜0.05；与纳米黄芪组比较，△P＜0.05；与自然恢复组比较，▲P＜0.05。下同。

组 别 n 双歧杆菌 乳酸杆菌 肠杆菌 肠球菌模型组 8 8.14±0.61* 7.46±0.41* 10.01±0.71* 10.02±0.59*正常组 9 10.22±0.28 10.05±0.50 6.83±0.47 7.18±0.02纳米黄芪组 9 10.36±0.38▲ 10.16±0.43▲ 7.23±0.18▲ 6.73±0.50▲丽珠肠乐组 9 10.02±0.37▲△ 9.02±0.31▲△ 8.19±0.35▲△ 7.64±0.29▲△自然恢复组 8 9.04±0.06 8.17±0.26 9.89±0.67 9.27±0.04

2.3 各组乙酸含量比较见表2。与正常组相比，模型组乙酸含量显著下降，且差异具有统计学意义（P＜0.05）。纳米黄芪组与丽珠肠乐组乙酸含量显著明显上升，与自然恢复组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 各组肝脏细菌易位检测结果见表3。与正常组相比，模型组肠杆菌数量明显上升（P＜0.05）。纳米黄芪组与丽珠肠乐组肠杆菌数量显著上升下降，相比自然恢复组具有显著差异 （P＜0.05），纳米黄芪组与丽珠肠乐组之间的差异具有统计学意义（P＜0.05），纳米黄芪组降低肠杆菌易位的作用优于丽珠肠乐组。

表2 各组乙酸含量比较（mg/mL，x±s）

表3 各肝脏细菌易位检测结果比较（lgN／g，x±s）

3 讨 论

机体与其正常菌群作为一个整体存在，它们既相互依赖又相互制约。纳米中药黄芪对双歧杆菌、乳酸杆菌数量的升高具有明显促进作用，可以降低肠杆菌、肠球菌的数量。可见纳米中药黄芪可以显著改善肠道微生态失调［3-9］。

大鼠肠道微生态失调后，厌氧菌代谢产物乙酸的含量显著下降，经7 d的药物治疗，大鼠肠道菌群失调得到调整，肠道内厌氧菌的数量上升，同时厌氧菌代谢产物乙酸的含量也迅速上升。

经过7 d治疗，大鼠肝脏细菌易位数量大幅度下降，与同时期自然恢复组相比，差异有极显著性，说明纳米中药黄芪能有效控制肝脏的需氧菌易位。其机制可能是通过增强网状内皮系统的吞噬能力和机体免疫力来完成的。

纳米中药黄芪与丽珠肠乐对微生态失调大鼠均具有调整菌群失调的作用，但从检测指标的结果比较中可以看出纳米黄芪的作用优于丽珠肠乐（活菌制剂）。其原因可能与中药双向性调节有关。扶正固本类中药不仅具有良好的扶植正常菌群的作用，而且具有提高机体免疫力的效果［10］。

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