松花粉抗氧化活性与主要成分的关联分析

董素哲，裴瑾，刘薇，张祎楠，万德光

松花粉(Pollenpini)是松科植物马尾松(Pinus massonina Lamb)、油松(Pinus tabulaefermis Carr)或同属数种植物的干燥花粉，具有燥湿，收敛止血的功效[1]。作为祖国医药学宝库中食、药兼用的花粉品种，松花粉的应用非常广泛。由于松花粉具有提高抗氧化能力，增强免疫功能，延缓衰老[2]等作用，本论文以清除羟基自由基、清除DPPH自由基的能力为指标，分别对不同来源松花粉的抗氧化性进行了研究；同时测定总黄酮、总甾醇与总多糖的含量，并对其与清除自由基的IC50进行多元相关分析，以探讨松花粉抗氧化作用的活性部位，为松花粉质量控制和药用资源的开发提供依据，同时也为松花粉破壁与否提供一定的参考。

1 仪器与材料

松花粉、破壁松花粉（来源详见表1）；芦丁对照品、D-葡萄糖对照品、β-谷甾醇对照品（中国药品生物制品检定所）；DPPH（美国Sigma公司）。KQ5200E型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）、UV-1100分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）、BP121S电子天平（德国Sartorrius）等。

2 方法

2.1 抗氧化能力的测定

称取2.0 g松花粉于锥形瓶中，加入40 mL95%乙醇超声提取40 min，静置，分别取上清液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL置于10 mL容量瓶中，定容，得待测液，用于清除DPPH自由基的测定。分别称取松花粉0.1 g、0.3 g、0.5 g、0.7 g、0.9 g于锥形瓶中，加入50 mL95%乙醇超声提取40 min，静置，取上清液为待测液用于清除羟基自由基的测定。采用文献[3]的方法分别测定其清除DPPH自由基与羟基自由基的能力。

2.2 总黄酮、总甾醇、总多糖的含量测定[4～6]

用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法，以芦丁为对照品，用紫外分光光度法在500 nm处测定，标准曲线A=11.349C+0.0001，R2=0.9999，在8.08～48.48 μg.mL-1线性关系良好。用浓硫酸显色法，以β-谷甾醇为对照品，用紫外分光光度法在416 nm处测定，标准曲线A=5.5268C-0.0019，R2=0.9996，在16.0～80.0 μg.mL-1线性关系良好。用苯酚-浓硫酸法，以D-葡萄糖为对照品，用紫外分光光度法在492 nm处测定，标准曲线A=25.327x+0.1592，R2=0.9998，在11.2～56.6 μg.mL-1线性关系良好。

2.3 量效曲线的拟合

通过检测不同浓度的样品对自由基的清除率，在不同浓度范围内进行曲线拟合，以相关系数R2为指标确定样品浓度检测范围，以自由基清除率为50%时样品的浓度（IC50）来衡量样品对自由基的清除能力，IC50越小，表明样品清除自由基的能力越强，每种样品取3份，平行测定，取其平均值计算。

根据自由基清除率范围来确定样品浓度范围，自由基清除率在10%～90%时相关性较好，在该范围内相关系数大于0.95，不同部位样品量效关系呈y＝ax+b相关性，y为清除率（%），x为样品浓度（g/mL）。

2.4 多元相关分析

分别采用SPSS17.0、OFFICE EXCEL两种数据分析软件对清除DPPH自由基的IC50、清除羟基自由基的IC50与总黄酮、总甾醇、总多糖的含量做多元相关性分析。

3 结果

3.1 DPPH自由基清除能力

试验结果显示，一定浓度范围内样品的对数浓度与自由基清除率呈线性关系，清除率在10%～90%时，线性关系良好，所有标准曲线的相关系数均大于0.95，因此，本方法的吸光度可较好的反映自由基清除率。IC50反映了清除自由基的能力，IC50越小，则清除自由基的能力（即抗氧化能力）越大，反之亦然。结果表明，松花粉具有良好的清除DPPH自由基的能力，不同来源的松花粉的清除能力存在一定差异，破壁松花粉的清除能力（IC50平均值为12.95 g.L-1）略高于未破壁松花粉（IC50平均值为14.86 g.L-1），详见表1。

3.2 羟基自由基清除能力

试验结果表明，松花粉具有良好的清除羟基自由基的能力，不同来源样品的清除能力存在一定差异；破壁松花粉的清除羟基自由基的能力（IC50平均值为3.45 g.L-1）明显高于未破壁松花粉（IC50平均值为20.31 g.L-1），详见表1。

3.3 总黄酮、总甾醇、总多糖的含量

试验结果表明，不同来源松花粉中总黄酮（0.16～0.75%）和总甾醇（0.98～7.67%）的含量差异较为明显，而总多糖的含量则相差不大（5.25～6.98%）；破壁松花粉中总黄酮和总甾醇的平均含量分别为0.68%、4.13%，略高于未破壁松花粉，其平均含量分别为0.27%、3.94%，详见表1。

表1 清除DPPH、羟基自由基与含量测定试验（n=3）

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3.4 清除自由基能力与总黄酮、总甾醇、总多糖含量的关联分析

通过多元相关分析表明，清除DPPH的IC50、清除羟基自由基的IC50分别与总黄酮、总甾醇的含量有负相关关系，与总多糖的含量有正相关关系；其中，与总黄酮含量的负相关关系最为密切，详见表2。

表2 清除自由基能力与总黄酮、总甾醇、总多糖含量的多元相关分析

4 结论与讨论

松花粉作为生命的遗传物质，富含蛋白质、氨基酸、碳水化合物、维生素、脂类等多种营养成分，以及酶、辅酶、激素、黄酮、多肽、微量元素等生理活性物质，因此有“微型营养库”之美誉。在国内外已被广泛地应用于保健品、药品、化妆品和饲料添加剂等领域。松花粉药食兼用的历史已逾数千年，我国利用松花粉的历史至少可追溯到2400年前，《神农本草经》中就记载“松黄”“久服轻身益气力，延年”，同时现代研究也表明松花粉具有提高抗氧化能力，增强免疫功能，延缓衰老，保护心脑血管，降低血脂等功效[7]。

本论文采用清除DPPH和羟基自由基的方法来评价松花粉的体外抗氧化活性，结果表明松花粉具有一定的抗氧化能力。松花粉清除DPPH自由基的能力优于清除羟基自由基的能力；不同来源松花粉样品间清除羟基自由基能力的差异较其清除DPPH自由基的能力明显；破壁松花粉的清除能力明显优于未破壁松花粉，提示松花粉破壁的必要性。

黄酮与甾醇的抗氧化作用已被公认，松花粉含有多种黄酮类化合物，主要为黄酮和黄酮醇类，其次是二氢黄酮醇类。中国林业科学研究院亚热带林业研究所研究松花粉中含有丰富的甾醇，并用二氧化碳超临界提取物制成降血脂的产品，把植物甾醇列为产品的有效成分指标[8]。本论文测定了不同来源松花粉的总黄酮、总甾醇与总多糖的含量并对其与抗氧化性进行关联分析，以寻找松花粉抗氧化的活性成分。结果表明不同来源的松花粉总黄酮与总甾醇的含量存在较大的差异。松花粉清除羟基自由基、清除DPPH的能力与总黄酮、总甾醇的含量呈正相关，其中，总黄酮的相关性更高。而样品间总多糖的含量差异较小，且与抗氧化能力关联性不大。初步推测总黄酮与总甾醇为松花粉抗氧化的活性组分，从而为以后松花粉活性成分的研究和其质量控制提供了一定的依据和基础。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2005,147.

[2] 何晓燕.松花粉的有效成分及药理作用[J].东北林业大学学报,2007,35(9):78.

[3] 樊青玲,张耀兮,李天才.藜叶中黄酮类化合物体外抗氧化活性研究[J].天然产物研究与开发,2009,21:672.

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2005,333.

[5] 庄华梅,雷然,付惠.野生半夏中β-谷甾醇含量的测定[J].湖北林业科技,2007,3:19.

[6] 刘敏,郭丽梅,张丽.苯酚-硫酸法测定油松花粉多糖含量研究[J].时珍国医国药,2010,21(6):1526.

[7] 刘协.松花粉的抗疲劳作用研究[J].中国生化药物杂志,2004,25(3):169.

[8] 王开发.花粉的植物甾醇研究[J].蜂蜜杂志,2006,9:5.