EDTA滴定法测定附子不同炮制品中的钙元素含量

耿昭，郭力，姚志昂，周勤梅，何成军，熊亮

附子为毛茛科乌头属植物乌头Aconitum carmichaeli Debx.的侧生子根及加工品。被誉为乱世良将，回阳救逆之第一品，补先天命门真火之第一要药[1]。首载于《神农本草经》[2]，列为下品，为攻邪要药。临床上一般不用生附子而用其炮制品，其炮制方法自唐代以后更加丰富起来，主要有白附片、黑顺片、盐附子等。《本经》曰：“其味辛温有大毒”，仲景炮附子有去皮、火炮。后世云：“古人用火炮，正是去其毒也”[3]，附子的炮制解毒[4～5]经历了火炮-液体辅料制-蒸制的过程，自汉代延续至今。

2010版《中国药典》收载了附子的三种炮制品盐附子、白附片、黑顺片，生附子在2010版《中国药典》并未收载，但在张仲景的《伤寒论》中很多处方使用了生附子而非炮制品，主要原因是当今附子药材种植面积较大，采收后如不经历胆巴水处理很容易变质腐烂，因此本研究中我们将生附子及各炮制品一并加以对照。由于胆巴水中含有大量钙元素，对附子不同炮制品中钙元素含量影响很大。本研究中采用的EDTA滴定法测定附子不同炮制品中钙元素的含量无文献报道，使用常规仪器就能得出可靠结果，较其他方法更为简便快捷，并节约实验成本。

1 材料与仪器

1.1 药材与饮片

白附片（20101001）、黑顺片（20101001）购自四川佳能达攀西药业有限公司，生附子（20101001）、盐附子（20101001）购自江油恒源药业集团有限公司，经成都中医药大学鉴定教研室李敏教授鉴定为道地药材。

1.2 仪器和试剂

1.2.1 仪器 酸式滴定管，高温烘箱，锥形瓶，坩埚，各种规格的容量瓶等。

1.2.2 试剂 (1) 钙标准溶液:称取2.780g 无水氯化钙溶于水中，然后定容至100mL，得10mg/mL钙标准液。(2) 0.01mol/L EDTA溶液：精密称取1.8537g EDTA于500mL容量瓶中，加水溶解后定容即得。(3)2 mol/LNaOH溶液：称取4.00gNaOH于烧杯中，溶解冷却后转入50mL容量瓶，定容。(4) 1 mol/LNaOH溶液：称取2.00gNaOH于烧杯中，溶解冷却后转入50mL容量瓶，定容。(5) 1 mol/LHCl溶液：用移液管量取5.00mL浓盐酸于50mL容量瓶中，加水至刻度即得。(6)钙指示剂：称取0.10g钙指示剂，加氯化钠10g，放入洁净研钵内研磨成细粉，装入玻璃瓶中备用。

2 实验方法

2.1 钙的测定方法

取250mL锥形瓶，加入一定量的标准液或待测液，加入蒸馏水50mL左右，加入2mol/LNaOH 2mL，加入钙指示剂0.05g。用0.01mol/ L EDTA 标准溶液滴定至溶液由紫红色变为纯蓝色即为终点。根据EDTA 用量和样品量求出钙的含量。

2.2 样品的制备

2.2.1 药材样品的制备 将黑顺片、白附片、盐附子、生附子粉碎至过二号筛，在60℃烘2小时，在干燥器中冷却至室温，依次精密称取5.0045g、5.0028g、5.0023g、5.0017g置于瓷坩埚中，于电热板上先低温炭化至无烟，移入高温炉中，于600℃灰化5.5小时，取出冷却，加10%盐酸溶液10mL使溶解，转入50mL容量瓶中，用水洗涤容器多次，合并洗涤液于容量瓶中，用1mol/LNaOH调pH6～8，定容，制得0.1g/mL黑顺片、白附片、盐附子、生附子药材的样品溶液。

2.2.2 煎煮液样品制备 分别精密称取已粉碎成小颗粒的黑顺片 10.00g、白附片 10.01g、盐附子10.02g、生附子 10.02g分别装于500mL圆底烧瓶中，加水100mL，加热回流1小时，趁热用滤布过滤，用清水洗涤残渣3次，过滤，分别合并滤液。分别收集残渣再加水100mL，加热回流1小时，过滤，洗涤3次并过滤，分别合并滤液。将同一原料的前后两次滤液合并，得到黑顺片、白附片、盐附子、生附子的水煎液。用蒸发皿将四种药材的水煎液挥干并用高温烧透，用5mL 1mol/LHCl溶解，过滤于50mL容量瓶，用水多次洗涤残渣，分别合并滤液，然后用1mol/LNaOH调滤液pH6～8，定容，制得0.2g/mL黑顺片、白附片、盐附子、生附子煎煮后的样品溶液。

2.3 测定钙的条件试验

2.3.1 EDTA的标定 取250mL锥形瓶，加入5mL钙标准液，加入蒸馏水50mL，加入2mol/L NaOH 2mL，加入钙指示剂0.05g。用0.01mol/L EDTA 标准溶液滴定至溶液由紫红色变为纯蓝色即为终点。平行测定3次。将“加入5mL的钙标准液”改为“加入5mL蒸馏水”，依法测定，记录结果。平行测定3 次。

实验结果显示：“加入5mL钙标准液”对应的平均读数是10.2mL。“加入5mL蒸馏水”对应的平均读数是0.3mL。

2.3.2 钙指示剂的用量 实验表明，当钙指示剂低于0.04g时，显色效果不明显，颜色太淡；当高于0.06g时，颜色太深，不好判断终点。因此选用0.05g为指示剂的用量。

2.3.3 NaOH的用量 NaOH主要用来调节pH值，pH值为12.5时准确度最高，重现性最好，因此选择NaOH的用量为2mL。

3 测定结果及对比

取黑顺片、白附片、盐附子、生附子药材样品及煎煮液样品，依钙元素测定方法测定，平行测定3次，记录实验数据如表1计算平均值；并进行对比分析，对比分析如图1。

溶出率计算：溶出率=（水煎液样品中钙元素含量 / 药材样品中钙元素含量）×100%

表1 各样品钙元素测定结果(单位：mg/Kg)

图1 附子各炮制品钙元素的含量及溶出率对比

结果表明，附子不同炮制品药材和水煎煮液中钙元素含量由大到小依次为：盐附子>黑顺片>白附片>生附子；溶出率由高到低依次为：盐附子>白附片>黑顺片>生附子。

4 讨论

4.1 从生附子及其炮制品药材中钙元素含量来看，炮制品中的钙元素含量远远高于生附子，因三种炮制品都经过胆巴水的浸泡，而胆巴水中含有大量的钙元素，钙元素是此过程引入。而生附子中的钙元素含量应为其自身从土壤中获得，因此几种炮制品中钙元素含量减去生附子当中的钙元素含量后得到的才是几种炮制品在炮制过程中获得的钙元素含量。盐附子中钙元素含量最高，原因是虽然其炮制过程中与白附片、黑顺片都经过胆巴水溶液浸泡，但并未经过漂洗，经过漂洗后，盐附子药材中钙元素含量为白附片药材的56倍，为黑顺片药材的4倍。从溶出率来看，各炮制品差异明显，其中白附片和黑顺片溶出率较盐附子低，主要原因也应该是漂洗后使得胆巴水附着在药材表面的含量降低，因此可以用溶出率来衡量炮制对药材中无机元素含量的影响。

4.2 生附子经过胆巴水浸泡后制为盐附子，一方面为了方便保存，另一方面则是为了减毒增效。文献[6]研究表明，钙离子具有调整心律，降低毛细血管和细胞膜的通透性，维持体内酸碱平衡的作用。而附子中的毒性成分乌头类生物碱常常引起心律失常，钙元素的引入可能就是为了制其毒性；当然，胆巴水本身对人体具有毒性，过多的钙元素引入亦可能会造成不良反应，因此白附片和黑顺片经过漂洗后制得，其钙元素含量均有所降低，在临床上更为常用。由此可见，附子的炮制通过改变钙元素含量可以使其更加安全有效以适合临床应用。

4.3 对附子不同炮制品中钙元素含量研究的文献并不多[7～14]，虽然报道不完整，仍可以看出炮制对中药附子中钙元素的含量影响很大。对中药材中钙元素含量测定方法常用的有容量分析法[15～16]、原子吸收分光光度法[17～18]、可见-紫外分光光度法[19]、毛细管电泳法[20]、ICP-AES法[21]等，本研究采用的EDTA滴定法测定附子不同炮制品中钙元素含量未见报道，而结果与文献[7]采用ICP-AES法报道附子炮制品中钙含量大量增加相符，但与其生附子、白附片及黑顺片的钙元素含量相差较大，可能是测定方法差异及药材产地、批次、炮制方法差异引起的，因此对更多附子不同产地、炮制品种及批次的药材进行研究和加以验证完善将是今后进一步研究的重点。

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