茚三酮法定性定量检测丝氨酸

关洪亮，熊 倩，余训民，李庆新

(武汉工程大学环境与城市建设学院，湖北 武汉 430074)

0 引 言

随着人们对丝氨酸生理作用的深入认识和医药保健事业的不断发展，医药、食品、饲料等行业对丝氨酸的需求量正迅速扩大.虽然L-丝氨酸属于非必需氨基酸，但它却具有许多重要的生理功能及用途，在医药、食品、化妆品中均有较为广泛的应用.因此，测定混合氨基酸中丝氨酸的含量对丝氨酸的开发利用具有重要意义.

α-氨基酸与茚三酮在弱酸性溶液中共热，反应后经失水脱羧生成氨基茚三酮，再与水合茚三酮反应生成紫红色或蓝色物质，如图1.脯氨酸等仲胺氨基酸与茚三酮反应生成黄色物质.丝氨酸和茚三酮在弱酸性条件下共热可以生成紫红色的缩合物质[1-3]，且其颜色随着丝氨酸的含量变化而有所不同.

图1 α-氨基酸与茚三酮的显色反应Fig.1 Colour reaction of α-amino acid and ninhydrin

上述反应生成的紫红色缩合物颜色的深浅还与反应的pH、显色剂的用量、反应的温度及时间有关.本文利用显色反应，采用比色法定量检测丝氨酸并探讨了最佳的反应条件.

1 实验材料与方法

1.1 实验仪器与试剂

722E可见光分光光度计；层析滤纸；毛细管；25 μL微量进样器；薄层色谱展开缸(规格100×100)；干燥箱；带塞玻璃试管(比色管).

1g/L的L-丝氨酸标准溶液：称取0.1 g丝氨酸溶于100 mL去离子水中.

展层剂：按照“正丁醇∶95%乙醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶1∶2”比例配制，均为AR.

0.1%茚三酮溶液：称取0.1 g茚三酮溶于95%乙醇中，定容至100 mL，均为AR.

层析液(0.1%茚三酮-展层剂)：每10 mL展层剂中加入2.5 mL 0.1%茚三酮溶液.

洗脱液：按照“V(0.1%CuSO4)∶V(75%乙醇)=2∶38”比例配制.称取0.156 5 g CuSO4·5H2O溶于去离子水中，定容至100 mL，配制成0.1%CuSO4溶液.

待测样品：氨基酸混合液，含有丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸等.

1.2 实验方法

1.2.1 茚三酮法定性检测丝氨酸 将预先配制的层析液倒入展开缸中静置20 min，使缸内环境达到平衡，在距滤纸下端2 cm处划一横线，将待测样品用毛细管点样于横线上，点样半径不要超过2 mm，将L-丝氨酸标准溶液用毛细管点样于距待测样品点1.5 cm处的横线上，点样半径不要超过2 mm.待样液自然挥发干后倾斜放入展开缸中，下端1 cm左右浸入层析液中，上端高出展开缸的部分延展开缸边缘折叠挂于展开缸上，确保滤纸不与展开缸内壁接触，如图2.待层析液上行至距折线1 cm左右时取出滤纸，放入105 ℃的干燥箱中干燥5 min[4].

图2 层析示意图Fig.2 Diagrammatic sketch of chromatography

1.2.2 茚三酮法定量检测丝氨酸 将预先配制的层析液倒入展开缸中静置20 min，使缸内环境达到平衡，在距滤纸下端2 cm处划一横线，用微量进样器取1 g/L丝氨酸标准溶液点样于横线

上，待样液自然挥发干后倾斜放入展开缸中，如图2.待层析液上行至距折线1 cm左右时取出滤纸，放入干燥箱中，在105 ℃条件下干燥5 min.干燥后的滤纸上会呈现明显的氨基酸显色斑点，剪下氨基酸显色斑点，将其放置于带塞玻璃试管中(比色管)，用4 mL洗脱液洗脱35 min，再倒入比色皿中静置24 h(确保液体中的纸末全部沉淀)，以洗脱液为对照样，在722E分光光度计上(波长570 nm处)测定吸光度[5-6].

2 检测结果与讨论

2.1 茚三酮显色反应的影响因素

2.1.1 溶液pH的影响 用1 mol/L的NaOH溶液和1+1的硫酸溶液将层析液分别配制成pH为1.03、2.02、2.50、3.05、4.50的溶液，用微量进样器取5 μL丝氨酸标准溶液点样，进行层析显色.

由于层析液在碱性条件下分层，所以用1 mol/L的NaOH溶液和1+1的硫酸溶液将1 g/L丝氨酸标准溶液分别配制成pH为6.56、8.77、9.50、11.05、12.05，取5 μL点样，将层析液配制成弱碱性溶液，进行层析显色[7].

实验结果归纳于表1.

表1 pH对显色反应的影响Table 1 pH on the colour reaction

注： 1 g/L丝氨酸标准溶液5 μL；105 ℃下烘干5 min；每10 mL展层剂加入2.5 mL 0.1%茚三酮溶液

由表1可知，当溶液pH低至2.0时不显色，从pH为2.5开始有淡紫色出现，但pH超过9.5时淡红色不是很明显，之后不再显色，可知显色范围在2.50～9.50之间，α-氨基酸[1]和茚三酮的显色反应对介质的pH值非常敏感.

学者研究表明：α-氨基酸和茚三酮显色反应中，主要的颜色产物均通过缩合形成.与羰基化合物和氨的衍生物之间的反应类似，在弱酸性条件下，这种缩合反应更容易发生[5,8]，酸性条件还能减少氨基以外的其它基团对显色反应的干扰，使显色反应生成的颜色产物更稳定.强酸性介质中虽然能增强茚三酮或1,3-茚三酮羟基的反应能力，但在强酸性条件下却降低了参与缩合反应的氨基、羟基等新核基团的活性，使有色的缩合产物形成困难而且缩合生成的颜色产物在强酸性介质中也不稳定.在碱性条件下，显色反应需加热才能完成，而且在离热后，空气中的氧分子或其他氧化物容易与还原型的有色缩合产物发生氧化还原反应，引起颜色变化甚至褪色.又因在碱性介质中，很多基团或化合物的还原能力得到加强，扩大了茚三酮的显色反应范围，使得副反应增多，从而使反应、反应产物及产物颜色变得复杂化，在分子内部因素和外来因素的双重影响和干扰下，不利于茚三酮对α-氨基酸的检验和测定，并且碱性介质中颜色的不稳定也妨碍了对α-氨基酸的准确分析[5].

综上所述，α-氨基酸和茚三酮的显色反应宜在弱酸性下进行.因此，本实验中选定层析液的pH为4.50左右.

2.1.2 显色剂用量的影响 取8组20 mL配制好的展层剂，分别加入0.4、1.2、2.0、2.8、3.6、4.4、5.2、6.0 mL 0.1%茚三酮溶液，作为层析液，调节层析液pH至4.50左右.用微量进样器取1 g/L丝氨酸标准溶液15 μL点样于滤纸上，进行层析[9-10].按照实验方法测定每个显色体系的吸光度并绘制成图，结果见图3.

图3 显色剂用量对吸光度的影响Fig.3 Dosage of chromogenic agent on absorbance

由图3可看出，吸光度开始时随着显色剂用量的增加而增大，然后趋于平衡.当显色剂用量为2.2 mL时，吸光度上升到最大，之后再增加显色剂用量，吸光度基本无明显变化，因此显色剂用量为2.2 mL时最佳.因此，本实验中选择每10 mL展层剂中加入2.5 mL显色剂.

2.1.3 反应温度及时间的影响 反应需在加热状态下进行，因此反应温度及时间对显色效果也存在较大影响.取4组20 mL展层剂，分别加入5 mL显色剂并调节pH至4.50左右.用微量进样器取1 g/L丝氨酸标准溶液15 μL点样于滤纸上，进行层析[7].分别放入105、90、75、60 ℃的温度下显色，结果见表2.

表2 反应温度及时间对显色效果的影响Table 2 Reaction temperature and time on colour effects

注： 丝氨酸标准溶液为1 g/L；每10 mL展层剂中有2.5 mL显色剂.

由表2可知，当温度为60 ℃时，即使加热13 min以上也只显出淡紫色；温度为75 ℃时，加热7.5 min才出现颜色变化；温度为90 ℃时，加热6.5 min就有颜色变化；当温度上升到105 ℃时，加热3.7 min即出现明显的颜色变化.综合各方面的考虑，反应的最佳条件应选在105 ℃下加热4～5 min.若加热时间过长会导致显色斑点颜色扩散，影响吸光度的测定.

2.2 实验结果分析

2.2.1 标准曲线的绘制 取5组20 mL层析液，pH调至4.55，用微量进样器分别取1 g/L丝氨酸标准溶液5、10、15、20、25 μL点样于层析滤纸上，按实验方法进行实验，测定吸光度，以标准溶液的用量与吸光度做丝氨酸标准曲线[10]，见图4.

图4 丝氨酸标准曲线Fig.4 Standard curve of serine

从图4可知，丝氨酸用量与吸光度呈线性关系，其回归线方程为y=0.001 7x-0.000 2，相关系数R2=0.993 8.

2.2.2 测定方法的精密度 精密度[11]一般用相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)表示.

取一定量的丝氨酸溶液，按照实验方法，进行多次比色测定(n=5)，计算丝氨酸含量，结果见表3.

表3 重复性实验结果Table 3 Repetitive experimental results

注： pH为4.55；105 ℃下烘干5 min；每10 mL展层剂加入2.5 mL 0.1%茚三酮溶液.

由此可见，此测定方法的重复性较好，精密度较高，比较可靠.

3 结 语

茚三酮比色法定量检测丝氨酸操作简单、成本低.只要控制好实验条件，就能取得较好的测量结果.本文探讨了溶液pH、显色剂用量、反应温度及时间对茚三酮比色法定量检测丝氨酸的影响，测定了丝氨酸标准曲线并得到了最佳实验条件：溶液pH为4.50，显色剂用量为每10 mL展层剂中加入2.5 mL 0.1%茚三酮显色剂，在105 ℃下加热5 min.

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