人参皂苷Rg1对大鼠血管球囊损伤后原癌基因c-myc表达的影响①

高 杨，邓 江，黄燮南

(遵义医学院药理学教研室暨贵州省基础药理重点实验室，贵州 遵义 563000)

人参皂苷Rg1(Rg1)为我国名贵中药材人参 (panax ginseng C.A.Mayer)干燥根的主要活性成分之一［8］。研究表明，在离体实验的条件下，Rg1可抑制肿瘤坏死因子-α所致血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)增殖［1，2］;我们的既往也发现，Rg1具有抑制球囊损伤所致大鼠颈动脉内膜增生［3］等作用。有学者认为，VSMC增殖需要原癌基因 c-myc转录的增加［4，5］，但 Rg1 能否影响c-myc基因的转录还不清楚。本研究旨在利用球囊损伤所致颈动脉狭窄模型，探讨Rg1抗血管新生内膜增生作用与原癌基因c-myc表达的关系。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂和仪器 主要药品、试剂、仪器及其来源如下:Rg1(纯度95%，北京天然药物研究院)、c-myc和β-actin引物(TaKaRa生物工程公司)、High-Capacity CDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)、SYBR(r)GREEN PCR Master Mix(Warrington WA14SR.UK)、RNA 纯化试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)、2F球囊导管(美国edwards lifescience公司)、Leica光学显微镜及照相系统(德国 Leica Microsystems Ltd)、实时荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司)、RNA逆转录仪(德国Eppendorf公司)。

1.2 实验动物 清洁级雄性SD大鼠35只，体重325±25 g，由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供(许可证号:SCXK-(军)2007-017)。

1.3 大鼠颈总动脉球囊损伤模型制备及动物分组动物禁食12 h，用20%水合氯醛0.2 ml/100 g腹腔注射麻醉后固定。切开颈部正中皮肤，分离左侧颈总动脉及颈外动脉，结扎颈外动脉远心端，将2F球囊导管从颈外动脉近心端插入至颈总动脉起始部。注入约0.1 ml生理盐水使球囊充盈，然后缓慢来回推拉球囊导管3次以剥脱颈动脉内皮，然后退出导管，结扎左颈外动脉，缝合切口。术后注射12万U/只苄星青霉素预防感染，清醒后置笼喂养。将大鼠随机分为假手术(颈部皮肤切开但不插球囊导管)组、模型组、造模后给Rg14和16 mg/kg两组。术后次日开始腹腔注射给药，模型组与假手术组给予等体积生理盐水。连续给药14 d后再次麻醉大鼠，迅速取出损伤的左颈总动脉，生理盐水洗净，取中间段放入10%中性福尔马林中固定24 h，石蜡包埋后用于形态学观察。剩余标本置液氮中速冻，然后放-70℃冰箱中冻存用于realtime RT-PCR检测。

1.4 血管腔面积的测定 常规石蜡包埋切片后，行苏木精-伊红(H.E.)染色，Leica光学显微镜下观察血管腔狭窄情况，拍照记录后用Q Win图像处理与分析系统测定管腔面积。每个标本观察3张切片，取平均值。

1.5 real-time RT-PCR检测VSMC中c-myc mRNA的表达 取冷冻血管标本置于0.5 ml trizol液中，充分匀浆至组织完全裂解，按照trizol试剂盒说明书提取RNA，纯化后进行样品纯度鉴定。两步法逆转录-聚合酶链反应如下:从基因库GeneBank中查出相关引物序列，由TaKaRa生物工程公司合成相应引物(见表1)。PCR反应体系为20 μl第一步，95℃ ×10 min;第二步，95℃ ×15 s，退火温度 ×1 min，循环45次。结果分析处理(相对定量法)，以Ct值为统计参数依次计算下列数据:① Ct平均值=(Ct1+Ct2+Ct3)/3(重复管);② dCt=Ct平均值-中间值;③基因的表达=2^(-dCt);④相对定量=目的基因的表达/内参基因的表达。

表1 real-time RT-PCR的引物序列

1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件处理，各项指标均采用均数±标准差(s)表示，多组间比较采用单因素方差分析(One Way ANOVA)，P＜0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1 Rg 1对大鼠颈动脉球囊损伤后管腔面积的影响 H.E.染色切片经图像分析的结果表明，模型组在球囊损伤后血管腔面积仅为假手术组的31.1%左右。Rg1低剂量组和Rg1高剂量组管腔狭窄程度均较模型组明显减轻 (P＜0.05)，已分别恢复到假手术组的63.9%和90.8%(见图1)。

2.2 Rg1对大鼠颈动脉球囊损伤后血管壁c-myc mRNA表达的影响球囊扩张损伤颈动脉可明显上调c-myc mRNA表达。与假手术组比较，模型组的c-myc mRNA表达为前者的近21倍(P＜0.01)。Rg14 mg/kg还不能降低损伤所致血管壁c-myc基因的过度表达，当其剂量为16 mg/kg则能明显下调由球囊损伤所致的c-myc mRNA表达的增高(P＜0.01)，使之恢复到假手术组的9倍 (P＜0.01)(见图2)。

图1 Rg 1对大鼠颈动脉球囊损伤后管腔面积变化的影响(s，n=5～7)

图2 Rg1对大鼠颈动脉球囊损伤后c-myc mRNA表达的影响(x ± s，n=4)

3 讨论

已知Rg1能抑制球囊损伤所致大鼠颈动脉内膜增生［1］，并通过抑制细胞外信号调节激酶、PI3K/PKB、蛋白激酶C-ζ等信号通路而抑制肿瘤坏死因子-α 所致 VSMC 增殖［2，3］。一般认为，在VSMC增殖过程中，由于信号通路的协同作用而导致核转录因子如c-fos和c-jun的转录，最后使cmyc 转录的增加［6］，这是 VSMC 增殖所必需［4，5］。因为c-myc作为一种核内蛋白质类原癌基因，在细胞的增殖、分化及凋亡过程中起重要的调控作用［7］，c-myc表达增高与VSMC增殖与迁移密切相关［8］。抑制早期原癌基因c-myc的表达可减缓和抑制内膜病变的形成，有利于再狭窄的防治［7］。

我们的血管腔面积测定结果表明，Rg1可明显增大球囊损伤后狭窄的血管管腔，从而进一步证实Rg1的抗球囊损伤所致血管内膜增生作用。本研究结果还表明球囊损伤后，血管壁c-myc基因表达显著增高，而Rg1 16 mg/kg可明显下调此基因的过度表达，该药4 mg/kg对c-myc mRNA表达也有抑制的倾向，表明其抗血管狭窄作用至少部分与其抑制c-myc基因表达有关。基于c-myc基因转录的增高是信号通路协同作用的结果［6］，因此，本工作也间接提示，Rg1在整体动物可能与其在离体培养VSMCs实验一样，通过抑制上述信号通路起作用。

［1］Ma Z C，Gao Y，Wang Y G，et al.Ginsenoside Rg1 inhibits proliferation of vascular smooth muscle cells stimulated by tumor necrosis factor-α ［J］.Acta Pharmacol Sin，2006，27(8):1000-1006.

［2］Zhang H S，Wang S Q.Ginsenoside Rg1 inhibits tumor necrosis factor-α (TNF-α)-induced human arterial smooth muscle cells(HASMCs)proliferation［J］.J Cell Biochem，2006，98(6):1471-1481.

［3］Gao Y，Deng J，Yang D L，et al.Ginsenoside Rg1 inhibits vascular intimal hyperplasia in balloon-injured rat carotid artery by down-regulation of extracellular signal-regulated kinase 2［J］.J Ethnopharmacol，2011，138(2):472-478.

［4］Biro S，Fu X M，Yu Z X，et al.Inhibitory effects of antisense oligodeoxynucleotides targeting c-myc mRNA on smooth muscle cell prolifration and migration［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90(2):654-658.

［5］Bennett M R，Evan G I，Newby A C.Deregulated expression of the c-myc oncogene abolishes inhibition of proliferation of rat vascular smooth muscle cells by serum reduction，interferon-gamma，heparin，and cyclic nucleotide analogues and induces apoptosis［J］.Circ Res，1994，74(3):525-536.

［6］Jeremy J Y，Rowe D，Emsley A M，et al.Nitric oxide and the proliferation of vascular smooth muscle cells［J］.Cardiovasc Res，1999，43(3):580-594.

［7］蒋伟，黄佩民，王书梅，等.DIM对兔血管损伤后平滑肌细胞c-myc表达的影响［J］.中国动脉硬化杂志，2011，19(7):570-572.

［8］Hilker M，Tellm ann G，BuerkeM，et al.Expression of the proto-oncogene c-myc in human stenotic aortocoronary bypass grafts［J］.Pathol Res Pract，2001，197(12):811-816.