r-hFSH制备卵巢过度刺激综合征动物模型①

李 权，徐 敏，李 艳，李清汉

(遵义医学院附属医院妇产科，贵州 遵义 563000)

辅助生殖技术目前已经成为治疗不孕症的重要治疗手段，使先前认为不能生育的夫妇拥有健康的子女，但是辅助生殖的并发症——卵巢过度刺激综合征是其主要的并发症，国内报道，卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)的发生率为23.3% ，其中重度为1% ～2%［1］。因其发生相对治疗来说相对滞后，由于伦理因素难以在人体进行，严重地制约该病的研究。目前国内外均有注射马促腺性激素建立大鼠卵巢过度刺激综合征的动物模型，且已用该模型对马促腺性激素的发病及治疗进行相关的研究，取得了一定的效果。但因目前国内外对马促腺性激素的生产已经停止，获取马促腺性激素相对较困难，需要寻找另一种激素制备OHSS的动物模型，更好地探索OHSS药物治疗效果及其发生的具体机制，我们用重组人促卵泡激素(Recombinant Human Folli-tropin Alfa Solution for Injection，r～hFSH)刺激Wistar大鼠制备了OHSS的动物模型。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级未发育雌性Wistar大鼠22日龄，体重42.0～45.0g，购于重庆医科大学动物实验中心。

1.2 EB 染料 Evens blue(EB，Sigma);Recombinant Human Follitropin Alfa Solution for Injection(rhFSH，Merck Seromno S.p.A.);human chorionic gonadot rophin(hCG;丽珠集团丽珠制药厂)。

1.3 方法 将20只22日龄雌性Wistar大鼠随机分成两组，每组10大鼠。实验组10只未发育雌性Wistar大鼠在第22～25日龄每日上午08∶30均腹腔注射10IU r～hFSH(用0.1 ml NS稀释)，第26日龄上午08∶30皮下注射hCG 30 IU(用0.1 ml NS稀释);对照组10只未发育雌性Wistar大鼠在第22～26日龄每日上午08∶30均腹腔注射0.1 ml NS。实验组与对照组在第28日龄上午08∶30经尾静脉注射1%EB染料0.1 ml，30 min脱颈法处死大鼠后立即腹水评分，无腹水或少量腹水者向腹腔灌注5 ml NS，灌注液收集10 ml试管中，均稀释到10 ml，再加入 0.05 ml 0.1 NaOH 液，以1000 r/min的速度在室温下离心10 min，用721分光光度计在波长600 nm处行比色测定，记录OD值。

1.4 观察指标

1.4.1 腹腔毛细血管通透性 根据标准浓度及其OD值绘制标准曲线，算出腹腔冲洗液EB含量。

1.4.2 腹水评分 大鼠脱颈法处死后，切开腹壁，参考Leng［2］的方法进行腹水评分:1分:无腹水;2分:少量腹水存在;3分:中量腹水存在;4分:腹水明显存在;5分:大量腹水存在或腹水从腹部切口溢出。

1.4.3 卵巢重量测量 取下双侧卵巢后立即用电子天平称重并记录其重量。

1.5 统计学分析 数据采用SPSS 11.0软件进行分析，结果以均数 标准差(s)表示，差异比较采用完全随机设计t检验，检验水准为0.05。

2 结果

实验组Wistar大鼠与对照组Wistar大鼠在第22日龄是体重分别42.0±1.05g与42.0±1.06g，两组比较无统计学差异(P＞0.05)。两组经过上述注射药物(实验组)或生理盐水(对照组)后第28日龄时检测腹腔EB含量、卵巢重量和腹水评分均有差异(P＜0.001)，(见表1)。

表1 两组腹腔液中EB含量、卵巢重量和腹水评分比较(s)

表1 两组腹腔液中EB含量、卵巢重量和腹水评分比较(s)

注:*:与对照组有差异，P＜0.001

组 别 腹腔液中EB含量(μg/ml)卵巢重量(mg)腹水评分实验组 4.324 ±0.372*389.00 ±23.30 *2.43 ±0.34*对照组0.312 ±0.032 29.37 ±4.26 1.00 ±0.00

3 讨论

OHSS是因为改变常发生在辅助生殖促排卵治疗过程中，也偶发生在正常的多胎妊娠中，因此认为与促腺性激素有关，但在诊断前其发生仍有不可预知性，是辅助生殖过程中最严重的一种临床综合征，临床表现主要包括卵巢增大、腹水及胸水，严重者因可出现生命危象而终止移植或放弃治疗周期。目前OHSS发生的病理生理机制还没有完全阐明，研究认为促排卵药物刺激后引起卵巢分泌血管活性物质的释放导致毛细血管通透性的增加是本病发生的关键因素［3］。由于常发生在辅助生殖过程中，由于伦理因素，OHSS的病理生理研究进展缓慢，需要复制动物模型进行相关的基础研究。

国外的OHSS模型大多选择恒河猴为造模对象［4］，但是价格昂贵，操作复杂，模型技术不易推广;国内选择未发育雌性Wistar大鼠以马促腺性激素建立OHSS的动物模型获得成功［5］，并在该动物模型上进行相关基础研究和药物试验，均取得了较好的效果［6］。限于马促腺性激素目前国内购买相对困难，而r-hFSH在临床上广泛应用，因此我们选择用中国仓鼠卵细胞经遗传工程生产的促腺性激素(r～hFSH)代替马促腺性激素，参照付永伦等［5］的文献建立OHSS的动物模型方法。研究结果显示在促腺性激素与生理盐水对照试验前Wistar大鼠体重无明显差异条件下，试验组每日经r-hFSH刺激后hCG促排卵，对照组生理盐水替代激素行相同的试验过程。在hCG注射后48h，即Wistar大鼠第28日龄时比较两组的卵巢重量、腹水评分和腹腔中EB浓度均有显著性差异，表明腹腔通透性在实验组明显增加，卵巢体积因卵泡的发育和通透性增加使重量增加，体积增大，与付永伦等［5］用马促腺性激素结果一致，与Golan［7］的卵巢过度刺激综合征诊断标准相符，说明我们成功制备了OHSS模型。

建立OHSS的动物模型对该病进行基础和临床研究，是生殖医师正确认识和研究超排卵导致OHSS病理生理和探讨临床治疗的主要手段之一。该动物模型的成功制备，可以研究OHSS的发生发展及病理生理过程，可以为研究药物对OHSS的治疗效果提供方便有效的手段，我们正在利用该模型进行相关的病理生理的基础研究。

［1］庄广伦.现代辅助生育技术［M］.北京:人民卫生出版社，2005，408-411.

［2］Leng P，Ho Yuen B，Moon YS.Effect of prolactin in an experimental model of the ovarian hyperstimulation syndrome［J］.Am J Obstet Gynecol，1983，145:847-849.

［3］Ohba T，Ujioka T，Ishikawa K，et al.Ovarian hyperstimulation syndrome model rats，the manifestation and clinical implication［J］.Molecular and Cellular Endocrinology ，2003，202:47-52.

［4］Molskness T A，Stouffer R L，Burry KA，et al.Circulating levels of free and total vascular endothelial growth factor(VEGF)-A，soluble VEGF receptors-1 and-2 ，and angiogenin during ovarian stimulation in nonhuman primates and women［J］.Hum Reprod，2004，19:822-830.

［5］付永伦，林其德，仲汗威.卵巢过度刺激综合征大鼠模型建立［J］.上海实验动物科学，2002，22(1):16-18.

［6］付永伦，林其德.RU486 OHS模型大鼠血管内皮生长因子产生的作用［J］.生殖与避孕，2005，25(5):263-267.

［7］Golan A，Ronel R，Soffer Y，et al.Ovarian hyperstimulation syndrome:an update review［J］.Obstet Gynecol Survey，1989，44:430-440.