血管紧张素转换酶2基因A9570G多态性与高血压合并左心室肥厚的相关性研究

胡双龙 陈文忠 李铭 李志樑 徐春生

左心室肥厚(left ventricular hypertrophy，LVH)是心血管疾病的独立危险因子，高血压患者一旦发生LVH，其心血管事件发生率明显增高。目前认为在LVH的发生发展中，肾素血管紧张素醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)发挥重要作用，主要通过其效应激素血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)参与心肌重构。血管紧张素转换酶2(angiotensin I converting enzyme 2，ACE2)是新近发现的活性酶［1］，是RAAS新成员，能水解AgⅡ成为血管紧张素1-7(angiotensin 1-7，Ang1-7)，参与心肌重构、血管收缩等病理生理过程，目前认为ACE2是心脏重要的保护因子。已有研究表明，ACE2基因的多态性可能影响血浆及局部心肌组织中ACE2的水平或活性［2］，而本研究试图探讨ACE2基因多态性与高血压患者左心室肥厚的关系。

1 对象和方法

1.1 研究对象

选择2007年3月至2010年10月在解放军421医院、广州市南沙中心医院、南方医科大学附属珠江医院内科门诊就诊及住院的无血缘关系的汉族原发性高血压初诊患者，诊断标准依据《中国高血压防治指南》2005年修订版，即坐位收缩压(SBP)＞140 mm Hg和(或)舒张压(SBP)＞90 mm Hg。排除标准:继发性高血压，近1年有充血性心力衰竭、心肌梗死病史，严重心律失常，合并有糖尿病、甲状腺功能亢进、先天性心脏病、瓣膜性疾病、心肌病、肺原性心脏病及其他研究者认为不适宜的患者。本研究共入选325例高血压患者，其中男性218例，女性107例，年龄32～74岁，平均(59.5 ±10.3)岁。所有患者行超声心动图评估心室重构情况，并分为高血压合并LVH组(LVH组，172例)及高血压未合并LVH组(NLVH组，153例)，同时于清晨6:00空腹抽取外周血2 ml，冷冻保存用于提取DNA。

健康对照组:按简单随机抽样的方法选取门诊健康体检者。经询问病史、体格检查、实验室检查、心电图、X线检查排除各类心血管疾病及糖尿病。共入选80例，其中男性40例，女性40例，年龄32～70 岁，平均(50.2 ±11.3)岁。

1.2 研究方法

1.2.1 临床资料采集 记录患者的性别、年龄、体质指数(BMI)、TC、TG、HDL-C、LDL-C、空腹血糖(GLU)、SBP、DBP 等。

1.2.2 超声心动图检查 采用美国Gevingmed公司system-five型彩色多普勒超声显像系统，探头频率2.5 MHz。测定左心室舒张末期内径(LVEDd)、舒张期室间隔厚度(IVST)、舒张期左心室后壁厚度(LVPWT)。计算左心室心肌质量(LVM)=0.8×1.04［(LVPWT+LVEDd+IVST)×3-LVEDd × 3］+0.6;左心室质量指数(LVMI)=LVM/体表面积(BSA)(g/m2)。左心室肥厚诊断标准采用Echo标准:LVMI:男≥112 g/m2，女≥104 g/m2。

1.2.3 DNA提取、扩增 采用Tiangen公司提供的外周血基因组DNA提取试剂盒提取DNA，紫外分光光度计测定DNA浓度，并标化DNA浓度值至20 mg/L，溶于TE中，-80℃冻存。DNA扩增采用25 μl反应体系，反应体系包括:10×buffer(含Mg2+)2 μl，10 μmol/L 上、下游引物各 0.5 μl，10 mmol/L 三磷酸脱氧核苷 1.6 μl，基因组 DNA 20 ng，5 U/L Taq DNA 聚合酶 0.2 μl，消毒双蒸水 19.2 μl。PCR 反应条件为:94℃预变性 1 min，94℃变性 40 s，58.5℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，32 个循环，72℃ 延伸加时7 min以终止所有反应。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳验证。

1.2.4 ACE2基因多态性检测 采用限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)的方法进行基因分型。上游引物序列为:5'-CATGTGGTCAAAAGGATATCT-3'，下游引物序列为:5'-AAAGTAAGGTTGGCAGACAT-3'。由北京三博远志技术有限责任公司合成引物。酶切反应体系20 μl，包括特异性 PCR 扩增产物8 μl，AluⅠ酶1 U，10 ×buffer(AluⅠ酶自带)2 μl，消毒双蒸水 9 μl。酶切温度:37℃，酶切时间:16 h。酶切产物点样于2%琼脂糖凝胶，以50 bp ladder标志作为判断DNA片段大小的标准物，100 V电泳35 min，在紫外灯下观察电泳条带以鉴定基因型。对各基因型随机抽样测序(Invitrogen生物技术有限公司)核实基因型。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 ACE2基因型酶切电泳结果

A基因型的PCR产物被酶切成281 bp和185 bp两个片段，G基因型的产物不能被酶切，电泳时仅有1个片段，长度为466 bp，而G/A杂合子表现为同时具有3个条带(图1)。

图1 酶切电泳条带

2.2 3组间临床资料比较

无论是男性还是女性，NLVH组和LVH组的SBP和DBP均高于对照组，差异有统计学意义(均为P＜0.05)，而NLVH组和LVH组比较，差异无统计学意义(均为P＞0.05)。3 组间年龄、BMI、GLU、TG、TC、HDL-C和 LDL-C比较差异均无统计学意义(均为P＞0.05)，见表1。

2.3 3组间基因型分布和等位基因频率的比较

由于ACE2位于X染色体，仅对女性进行遗传平衡吻合度检验，结果符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.076，P＞ 0.05)，表明样本的代表性好。按性别进行分类分析，在女性，3组间等位基因频率比较差异有统计学意义(χ2=9.970，P=0.007)，基因型分布差异也有统计学意义(χ2=10.387，P=0.034)，LVH组GG基因型及G等位基因频率高于NLVH组及对照组。在男性，3组间等位基因/基因型频率比较差异有统计学意义(χ2=12.742，P=0.002)，LVH组 G基因型/等位基因频率高于NLVH组及对照组，见表2。

表1 3组间临床资料比较

表2 3组间ACE2基因型分布和等位基因频率的比较［例(%)］

3 讨论

在新的RAAS体系中，ACE2可直接降解AngⅡ使其转变为 Ang1-7［3］，也可通过水解 Ang I生成Ang1-9，进而生成 Ang1-7［4］。Ang1-7 功能与 AngⅡ相反，表现为舒张血管、抗心血管增殖及抗纤维化形成［5-7］。通过调控血管紧张素的生成与平衡，ACE2对延缓心肌肥厚、心肌纤维化的形成发挥积极作用［8］。研究表明，在自发性高血压大鼠(spontaneous hypertensive rats，SHR)体内，ACE2的表达增加可以延缓SHR心肌结构损伤［9］。而在ACE2基因敲除小鼠体内AngⅡ水平升高，缺氧诱导基因表达上调以及心脏结构功能严重受损［10］。研究证实，利用转基因技术使SHR体内ACE2过表达，通过抑制心肌和血管周围的纤维化，最终延缓高血压心血管重构的发生发展［11］。ACE2的过度表达可预防SHR的病理性心肌肥厚、心肌和血管周围纤维化，降低其血压，同时还降低了其心肌梗死面积，改善心肌梗死的血流动力学［12］。

本研究探讨了ACE2基因A9570G多态性与高血压左心室肥厚的关系，结果表明，在女性，LVH组GG基因型及G等位基因频率均高于NLVH组及对照组。在男性，LVH组G基因型/等位基因频率也高于NLVH组及对照组，提示ACE2基因A9570G多态性与高血压患者左心室重构相关，ACE2基因A9570G多态性可能是影响高血压患者发生左心室重构的遗传因素，G等位基因可能是其易感基因，检测ACE2基因A9570G多态性有助于高血压患者预后的判断。ACE2基因A9570G多态性如何影响高血压左心室重构的发生发展目前尚不完全清楚，分子生物学研究已经明确ACE2基因定位于Xp22［13］，有18个外显子，迄今已知人类该基因的SNP位点有140个，绝大多数位于非编码的内含子区域，而本研究中的SNP位点A9570G位于第三内含子，紧靠外显子的位置，已有研究表明这个位点可以改变mRNA的剪接［14］，那么其改变就可能对基因的功能产生影响，而不仅仅是一个遗传标记。该位点的突变可能使其活性或表达增加，使ACE2更有效地降解AngⅡ，从而Angl-7生成增多。Ang1-7可明显降低体外心肌培养细胞中细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/ERK2)丝裂原活化蛋白激酶的活性，并通过激活Mas受体抑制心肌细胞增长，减轻心室功能紊乱和心室重构［15］。因此，我们推测ACE2基因多态性可能通过影响ACE2的表达或活性，进而调节Angl-7，参与高血压左心室重构的发生发展。深入探讨ACE2基因多态性与高血压左心室肥厚的关系，进一步揭示其对ACE2基因表达和功能的影响，将有助于阐明其发病机制，并为临床诊治提供新的思路。

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