血清可替宁水平与冠心病的关系

杨睿悦 刘君萌 何青 国汉邦 李红霞 王抒 董军 陈文祥

流行病学研究发现，吸烟是冠心病(coronary artery disease，CAD)等心血管疾病的重要危险因素。这些研究多通过调查每日吸烟支数的方法对吸烟暴露水平进行评价，容易引入偏倚，而且这种调查报告的方法也无法很好地评价被动吸烟的暴露水平［1］。近年来，有研究开始用生物样本中可替宁(cotinine)水平来评价吸烟暴露水平，精密性和客观性明显提高［2-4］。可替宁并非烟草中的固有成分，是烟草中的主要成分尼古丁(nicotine)在体内代谢的主要产物，它的生物半衰期为18～22 h，较尼古丁延长了约20 h，能反映人体3～4 d的暴露情况，是一种可靠的、具有潜在应用价值的生物学标志物［2］。本研究通过分析和比较经冠状动脉造影证实为CAD和非CAD者的血清可替宁水平，探讨其与CAD及其他危险因素间的关系，旨在为其临床应用提供进一步的理论依据。

1 对象和方法

1.1 对象

连续录取2009年5月至2010年3月于卫生部北京医院心内科住院并行冠状动脉造影的患者149例。根据冠状动脉造影结果分为CAD组与非CAD组。CAD组97例，年龄39～83岁，平均(65.0±10.8)岁;非 CAD组52例，年龄34～84岁，平均(61.5±11.2)岁。冠状动脉造影采用Judkins法，应用常规标准技术行冠状动脉造影。CAD患者定义为冠状动脉造影显示左前降支、左回旋支、右冠状动脉及其主要分支中至少有一支血管管腔狭窄程度≥50%。非CAD患者定义为上述血管管腔狭窄程度均＜50%。有下列情况者予以剔除:(1)近6个月内服用过他汀类降脂药物(查阅病史记录及询问用药史);(2)近1个月内发生急性心肌梗死;(3)临床资料获取有困难者。收集吸烟、高血压、糖尿病、脑血管病、血脂异常和心血管病家族史(一级亲属患CAD或脑卒中)等资料，并测定血压，计算脉压和平均动脉压，计算体质指数(BMI)，BMI=体重/身高2(kg/m2)。吸烟者为每日吸烟≥1支、时间≥1年者;不吸烟者为平时不吸烟或戒烟＞1年者。本研究通过卫生部北京医院伦理委员会批准，研究对象均签署了知情同意书。

1.2 方法

所有研究对象均采集清晨空腹静脉血标本，分离血清后分装，－80℃冰冻保存待检。测定时将血清样品融化并使之恢复到室温，摇匀。可替宁采用同位素稀释液相色谱串联质谱法(isotope dilution tandem mass spectrometry，ID-LC/MS/MS)测定［5］。0.1 ml不同浓度的可替宁标准溶液或血清样品，加5 μg/L的D3-可替宁内标溶液0.1 ml，涡旋10 s;加0.5 ml乙腈，涡旋30 s，4℃ 3148×g离心15 min;吸取上清液0.2 ml置进样瓶中，室温下氮气吹干，流动相重组。液相分离后进入串联质谱分析;质谱采用多离子反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)模式，可替宁和内标离子通道分别选择为质荷比(mass to charge，m/z)177→80和m/z 180→80;以标准溶液可替宁浓度为X轴，可替宁和内标峰面积的比值为Y轴，进行线性回归分析，计算血清样品可替宁浓度。

Aemset abbott全自动生化分析仪(雅培公司，美国)测定空腹血糖(FBG)等血生化指标。Sysmex 2100全自动血细胞分析仪(东亚公司，日本)测定血常规。酶法测定血清TC、TG;超速离心高效液相色谱法［6］测定 LDL-C、HDL-C 和脂蛋白亚类 LDLa-C、LDLb-C、HDL2-C、HDL3-C;超敏 C反应蛋白(hs-CRP)测定采用酶联免疫吸附法(ELISA)。

1.3 统计学方法

数据采用SPSS 16.0软件包进行统计分析，主要指标均进行正态性检验;计量资料采用均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用方差分析，各组间均值两两比较采用LSD-t检验;计数资料采用百分构成比表示，组间比较采用卡方检验;血清可替宁数据呈偏态分布，用中位数(四分位数)表示，变量转换后仍未达正态，用非参数Mann-Whitney U检验比较组间差异;多因素Logistic回归分析采用进入法，最大似然比检验;相关性采用非参数Spearman相关性分析。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 可替宁分布和基线情况

149 例行冠状动脉造影的患者血清可替宁浓度呈偏态和尖态分布(偏度2.90，峰度7.96)，其中61例吸烟者的可替宁浓度为12.64(0.91～99.61)μg/L，显著高于88例非吸烟者的浓度［0.22(0.12～0.51)μg/L，P＜0.001］。按照血清可替宁水平将吸烟暴露水平分为3层，即＞10.00 μg/L的32例、1.00～10.00 μg/L 的18 例以及 ＜1.00 μg/L 的 99例;与低水平可替宁组比较，高水平可替宁组的男性比例和白细胞计数(WBC)水平显著升高(均为P＜0.05)，HDL-C和 HDL2-C显著降低(均为P＜0.05);其余指标3组间差异无统计学意义(均为P＞0.05)，见表1。

表1 149例冠状动脉造影患者基线资料

2.2 可替宁与CAD的关系

CAD组与对照组吸烟状况、可替宁水平比较见表2。吸烟者与非吸烟者相比，OR值为2.22(95%CI:1.08～4.57，P＜0.05)。高、中可替宁水平组与低可替宁水平组比较，OR值分别为2.94(95%CI:1.11～7.78，P＜0.05)和 1.36(95%CI:0.47～3.43，P＞0.05)，且随着血清可替宁水平的升高，OR值增大呈量效关系，卡方趋势检验值为5.01，P=0.027。提示吸烟、高血清可替宁水平可能增加CAD的发病风险。

2.3 CAD影响因素的Logistic回归分析

将性别、年龄、可替宁水平、BMI、糖尿病、高血压、血脂异常(入院后首次血脂检查结果为TC＞5.7 mmol/L或TG ＞1.7 mmol/L或LDL-C ＞3.6 mmol/L或HDL-C＜0.91 mmol/L者)作为自变量，是否患有CAD为因变量，进行Logistic回归分析。结果发现糖尿病、可替宁水平及血脂异常是CAD的独立影响因素，见表3。

表2 吸烟、血清可替宁水平与CAD的关系

表3 CAD影响因素的Logistic回归分析

2.4 可替宁与其他指标的相关性

血清可替宁水平与吸烟、WBC呈显著正相关(P＜0.05)，与 HDL-C和 HDL2-C呈显著负相关(P＜0.05)。可替宁与大颗粒的HDL2-C的相关系数(r=－0.217)较与HDL的(r=－0.184)更高，提示其与脂蛋白亚类的颗粒大小关系可能更为密切。可替宁对其他指标无显著影响(P＞0.05)，见表4。

表4 可替宁与其他指标的相关性

3 讨论

研究显示，吸烟与被动吸烟可增加CAD等多种疾病的发病风险。相比于调查问卷的方法，吸烟与心血管病等疾病的关系需要更加客观、准确的评价方法。随着近年液相色谱串联质谱(LC/MS/MS)分析技术的成熟，也迅速应用于反映吸烟暴露水平的生物学标志物可替宁的检测以及暴露与疾病发生危险的分析中［4，7-8］，如美国疾病控制中心开展的第三次全国健康与营养状况调查(NHANESⅢ)就用LC/MS/MS检测了数万人群体内可替宁与心血管疾病的关系［4］，但在我国相关研究还较少。此外，这些方法在样品预处理中大多采用液液萃取或固相萃取，提取过程繁琐、费时、成本较高。我们在之前的研究中建立了一种样品处理简便(仅需沉淀蛋白)、灵敏、准确的ID-LC/MS/MS测定人血清可替宁的方法，能够适用于大规模的临床和流行病学研究［5］。本研究利用此方法对CAD和非CAD患者的血清可替宁水平进行测定，并探讨了其与CAD及其他危险因素之间的关系。

文献报道绝大多数吸烟者血清中可替宁水平在10～400 μg/L;非吸烟者暴露于严重污染的烟草烟雾环境下，其水平在1～10 μg/L;而暴露于一般的烟草烟雾环境下其水平多低于1 μg/L［8-9］。本研究测定149例冠状动脉造影患者血清中可替宁水平发现，吸烟者和非吸烟者的可替宁水平与文献报道的浓度范围基本一致，吸烟者的可替宁水平显著高于非吸烟者(P＜0.001)，可替宁浓度与吸烟状况呈显著正相关(P＜0.001)，表明血清可替宁浓度能够有效地反映吸烟状况。故按照上述可替宁水平将吸烟暴露水平分为3层，进行分析。结果显示，吸烟者患CAD的危险是非吸烟者的2.22倍(P＜0.05)，高可替宁水平组患CAD的OR值更高(是低水平组的2.94倍，P＜0.05)，且随着可替宁水平的增加，OR值增大呈量效关系。在可替宁及其他常见危险因素(肥胖、糖尿病、高血压、血脂异常)与CAD的多因素回归分析显示，糖尿病、血脂异常及可替宁为最显著的危险因素。由此可见，血清可替宁水平增加，患CAD的危险增加，高水平可替宁是CAD的独立危险因素。但对之前基于大规模人群研究报道的性别、年龄、肥胖和高血压是CAD的独立危险因素在本研究中并未显现，可能与样本量较少以及对照组的选择有关。本研究对照组选择了因不典型性胸痛而入院拟行冠状动脉造影的患者，他们中大部分都或多或少具有CAD危险因素，而不是真正的阴性对照组，对结果的分析造成了一定影响。

吸烟通过多种途径增加CAD的发病风险，其中影响脂代谢是其主要机制之一。已有研究表明，吸烟以及可替宁水平升高，与血清HDL-C水平降低有关［10］。目前尚缺乏可替宁与脂蛋白亚类关系的研究。HDL-C降低是CAD的重要危险因素，最近研究证实HDL中对动脉粥样硬化有保护作用的是较大颗粒的 HDL2，而小颗粒 HDL3则无保护作用［11］。本研究首次对可替宁与脂蛋白亚类的相关性进行了分析，结果发现血清可替宁与HDL-C和HDL2-C呈显著负相关，对TC、TG、LDL-C及其亚类并无显著影响。可替宁水平越高，HDL-C和大颗粒的HDL2-C越低，对心血管保护作用越弱，从而加速动脉粥样硬化进程，具体机制尚需进一步研究。

吸烟还可通过炎症机制促进动脉粥样硬化疾病的发生发展，显著升高吸烟者WBC和CRP等炎症标志物的水平，从而增加心血管病发病危险［12-13］。而戒烟可使升高的炎症细胞和炎症因子水平随戒烟时间延长而进行性降低，并与心血管病危险的下降趋势一致［14］。本研究显示，血清可替宁水平与WBC呈显著正相关，但对hs-CRP无显著影响，可能是受到样本例数的限制，未显现出统计学意义。

总之，血清可替宁作为一个客观的生物学标志物指标，能够更有效地反映吸烟的暴露水平，具有更可靠的CAD的危险预示能力，有望在吸烟与CAD及其他疾病关系等研究中发挥重要作用。

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