wnt/β-catenin信号通路关键蛋白及Mucin1在喉鳞状细胞癌上表达与相关研究

刘 瑛 王斌全 高 伟 张春明 张海利 冯 彦 陈钢钢 温树信 皇甫辉

山西医科大学第一医院耳鼻咽喉头颈外科，山西太原 030001

Wnt/β-catenin信号转导通路调控细胞的生长与分化，参与恶性肿瘤进展，已成为近年来恶性肿瘤治疗的热点[1]。βcatenin为wnt/β-catenin通路中关键分子，在癌细胞中其表达增高，从胞膜进入胞质中，使该通路活化，从而使癌细胞进一步增殖、分化[2]。cyclinD1为wnt/β-catenin通路的下游关键基因[3]，通过检测其表达可以反映是否开启wnt/β-catenin通路的情况。Mucin1为分泌性糖蛋白，已有文献报道其可调控β-catenin在胞浆的表达，从而影响wnt/β-catenin通路[4]。目前Mucin1、β-catenin、cyclinD1三者联合在喉鳞状细胞癌上的表达尚无文献报道，故本实验在喉鳞状细胞癌与对照组的石蜡包埋组织标本中检测Mucin1与Wnt/β-catenin信号转导通路中的两种关键蛋白表达情况，旨在从生子生物学角度了解三者之间临床病理学指标的关系，研究其在喉鳞状细胞癌发生机制中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本实验选用2000年1月～2008年12月山西医科大学第一附属医院168例喉鳞状细胞癌患者与53例正常癌旁组织的石蜡切片，男159例，女9例，平均年龄61岁。按肿瘤发生部位分期：声门上型61例，跨声门型10例，声门型91例，声门下型为6例。按TNM分期标准（UICC，2010年）：T1期42例，T2期33例，T3期72例，T4期21例。病理学分期：低分化25例，中分化108例，高分化35例。无淋巴结转移133例，淋巴结转移35例。

1.2 免疫组织化学法（S-P 法）

严格按照免疫组织化学的步骤操作。简述如下：首先将石蜡切片经65℃～68℃烤箱内脱蜡3 h后进行梯度水化（100%、90%、80%、70%）各 3 min，PBS清洗后将 Mucin1、βcatenin用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，cyclinD1则用EDTA修复，再经3%过氧化氢封闭、正常山羊血清封闭液封闭后，加入一抗（Mucin1、cyclinD1 稀释倍数分别为 1∶500、1∶50，β-catenin为即用型抗体）后放入4℃冰箱过夜。第2天将组织切片复温1 h后加入二抗，经DAB显色、苏木素染色、中性树胶封片，最后放显微镜下观察。阴性对照用PBS代替一抗，用已知阳性组织切片进行对照。抗体选用：C595（NCRC48）MSmAb to Mucin1（ab8081，abcam）、MAB-0259 鼠抗人β-联蛋白免疫组化单克隆抗体、KIT-5010快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物、RMA-0541兔抗人周期素D1免疫组化单克隆抗体、DAB显色盒均购于福州迈新公司。

1.3 阳性评分标准

Mucin1参考Jeannon等[5]的方法，以癌细胞胞质中被染成棕黄色为阳性表达，0分为无阳性表达，1分为≤50%的弱阳性表达；2分为＞50%的强阳性表达。β-catenin参考Maruyama评判方法[6]在癌组织的胞膜上阳性率＞70%视为正常，反之为表达减弱；而胞质/胞核阳性率＞10%视为异位表达。cyclinD1的评判标准参照Morshed等[7]，即胞核有棕黄色颗粒沉积为阳性表达，＞5%记为阳性表达。

1.4 统计学方法

采用SPSS 10.0软件做 χ2检验、Spearman秩相关，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Mucin1、β-catenin与cyclinD1在喉鳞状细胞癌的表达

免疫组织化学S-P法染色结果显示，在喉鳞癌中Mucin1、β-catenin均为胞质呈棕黄色，cyclinD1为胞核棕黄色，并采用χ2检验分别在喉鳞癌组织与癌旁正常组织中的表达，结果显示 Mucin1在癌组织的阳性率为52.38%（χ2=20.502，P ＜ 0.01），β-catenin 的异位表达率为 67.86%（χ2=62.560，P ＜ 0.01），cyclinD1在癌组织的阳性率为 85.12%（χ2=118.158，P＜0.01）三者均在喉鳞癌组织中表达高于癌旁正常组织，差异具有高度统计学意义（P＜0.01）。见表1。

2.2 Mucin1、β-catenin与cyclinD1三者的相关分析

喉鳞胞癌组织中Mucin1有88例为阳性表达，同时有70例β-catenin阳性表达，78例 cyclinD1阳性表达，即随着Mucin1表达的增强，β-catenin与cyclinD1的阳性表达率也增高。进一步经Spearman秩相关分析，结果显示：Mucin1与β-catenin 呈正相关 （r=0.763，P=0.003），β-catenin 和 cyclinD1呈正相关 （r=0.431，P=0.021）。 而 Mucin1和 cyclinD1 之间无统计学意义（r=0.016，P=0.138）。

3 讨论

wnt/β-catenin信号转导通路是参与细胞生长与发育的经典途径之一[1]，若其传导障碍则引起细胞生长、分化异常，从而引发肿瘤的形成。β-catenin是wnt/β-catenin信号转导通路的关键蛋白，其浓度决定是否开启wnt/β-catenin信号转导通路。正常情况下，β-catenin主要在细胞膜上表达，而在胞浆中被降解，故在胞浆与胞核表达较少。在肿瘤细胞中，β-catenin不能被磷酸化，在胞浆的含量增多，甚至在胞核表达，激活了wnt/β-catenin信号转导通路，使细胞不断增殖、分化，最终引发肿瘤。在本次研究中，β-catenin在喉鳞状细胞癌组织中为胞浆异位表达，异位表达率为67.86%，而癌旁正常组织几乎无异位表达。这与黄种心等[8]报道的β-catenin在喉鳞状细胞癌组织中有明显的异位表达结论一致。国外也有相同报道，Goulioumis等[9]认为β-catenin在声门上喉鳞状细胞癌存在异常表达。

正常细胞增殖周期分为间期与分裂期，其中间期为3个阶段，包括G1期的DNA合成前期、S期的DNA合成期与G2期的DNA合成后期。cyclinD1为细胞周期素D1，为控制G1期到S期转换的关键因子之一。已有文献报道cyclinD1为癌基因，正常在胞膜上无或极少量表达而在癌细胞中表达增多，其生物学作用为调节细胞的周期从而控制细胞的增殖速度[10]。cyclinD1可作为wnt/β-catenin信号转导通路的重要下游基因，通过其可判断是否开启了wnt/β-catenin信号转导通路。当β-catenin在胞浆内堆积，甚至进入细胞核，激活cyclinD1控制细胞G1到S期转换，促进肿瘤细胞增殖。结合本次研究中cyclinD1在喉鳞状细胞癌组织中表达增高（阳性率为85.12%），染色结果表现为胞核中出现棕黄色颗粒样物，而在癌旁正常组织的无阳性表达。与Pignataro等[11]认为cyclinD1在喉鳞状细胞癌过度表达的观点相同。

Mucin1为分泌性糖蛋白，主要功能为参与细胞的粘附。Schroeder等[12]报道 Mucin1可直接控制β-catenin的浓度，从而调控wnt/β-catenin信号转导通路。在本次研究中，Mucin1在癌组织胞质成棕黄色，且阳性率为52.38%（χ2=20.502，P＜0.01）。Mucin1在喉鳞状细胞癌的研究尚无国内文献报道。本次研究还发现Mucin1、β-catenin与cyclinD1之间呈正相关，这与Prasad等[13]报道的β-catenin与cyclinD1在乳腺癌表达呈正相关的结论相符。而三者结合起来在喉鳞状细胞癌的表达相关性尚无文献报道，为进一步研究喉鳞状细胞癌发生发展提供新思路。

[1]Yao H，Ashihara E，Maekawa T.Targeting the Wnt/β-catenin signaling pathway in human cancers[J].Expert Opin Ther Targets.2011，15（7）：873-887.

[2]Fu Y，Zheng S，An N，et al.β-catenin as a potential key target for tumor suppression[J].Int JCancer，2011，129（7）：1541-1551.

[3]Larue L，Delmas V.The WNT/Beta-catenin pathway in melanoma[J].Front Biosci，2006，1（11）：733-742.

表1 Mucin1、β-catenin和cyclinD1在喉鳞状细胞癌与癌旁组织中的阳性表达情况（例）

[4]Uehara F，Ohba N.Mucin1 and sialoglycan expression associated with cytotoxic T lymphocyte infiltration in eyelid malignant tumours[J].Jpn J Ophthalmol，2002，46（3）：237-243.

[5]Jeannon JP，Stafford FW，Soames JV，et al.Altered Mucin1 and MUC2 glycoprotein expression in laryngeal cancer[J].Otolaryngol Head Neck Surq，2001，124（2）：199-202.

[6]Maruyama K，Ochiai A，Akimoto S，et al.Cytoplasmic beta-catenin accumulation as a predictor of hematogenous metastasis in human colorectal cancer[J].Oncology，2000，59（4）：302-309.

[7]Morshed K，Skomra D，Korobowicz E，et al.An immunohistochemical study of cyclin D1 protein expression in laryngeal squamous cell carcinoma[J].Acta Otolaryngol，2007，127（7）：760-769.

[8]黄种心，邱连升，张榕，等.喉鳞癌β-连环蛋白、细胞周期蛋白D1的表达与意义[J].福建医科大学学报，2005，39（4）：379-382.

[9]Goulioumis AK，Varakis J，Goumas P，et al.Differential beta-catenin expression between glottic and supraglottic laryngeal carcinoma [J].Eur Arch Otorhinolaryngol，2010，267（10）：1573-1578.

[10]Marsit CJ，Black CC，Posner MR，et al.A genotype-phenotype examination of cyclin D1 on risk and outcome of squamous cell carcinoma of the head and neck[J].Clin Cancer Res，2008，14（8）：2317-2377.

[11]Pignataro L，Pruneri G，Carbini N，et al.Clinical relevance of cyclin D1 protein over-expression in laryngeal squamous cell carcinoma[J].JClin Oncol，1998，16（9）：3069-3077.

[12]Schroeder JA，Adriance MC，Thompson MC，et al.Mucin1 alters βcatenin-dependent tumor formation and promotes cellular invasion[J].Oncogene，2003，22（9）：1324-1332.

[13]Prasad CP，Mirza S，Sharma G，et al.Epigenetic alterations of CDH1 and APC genes：relationship with activation of Wnt/beta-catenin pathway in invasive ductal carcinoma of breast[J].Life Sci，2008，83 （9-10）：318-325.