猪MHC 的分子遗传学研究进展

潘孝成

（安徽省农科院畜牧兽医研究所，安徽合肥 230031）

主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）是位于脊椎动物某一染色体上一组紧密连锁、高度多态性的基因群，根据其编码产物的化学结构、分布和功能可分为三类，即MHCⅠ、Ⅱ和Ⅲ。猪的MHC又称为猪白细胞抗原（swine leukocyte antigen，SLA），由Viza D等［1］于1970年发现。近年来，随着SLA各方面研究的不断深入，对SLA在正常免疫以及抗感染和疫苗免疫中角色的了解不断增多。Ⅰ类SLA与抗原表位多肽的结合方式及作用机理已成为研究和关注的重点。

1 SLA基因及其定位

在猪的基因组中，SLA是密度最高的基因区之一，其与人的MHC一样，也由3个基因簇组成，即SLAⅠ、SLAⅡ和SLAⅢ，定位于猪7号染色体的着丝粒的两边，SLAⅠ和SLAⅢ位于短臂的7p1.1区域，SLAⅡ位于长臂的7q1.1［2］。一种常见的猪SLA单倍型Hp－1.1（H01），其整个SLA区的测序和标记已经完成。结果显示，SLAⅠ、SLAⅢ和SLAⅡ区域的跨度分别是约1.1×106、0.7×106、0.5×106bp，是哺乳动物中迄今为止发现的最小跨度MHC和惟一一个跨越着丝粒的MHC。在整个SLA区，有超过150个基因已经被鉴定，至少121个为功能性基因［3－4］。

在猪白细胞抗原（SLA）Ⅰ类区共有7个经典的SLAⅠ类基因，最靠近着丝粒的是SLA11，接着是SLA－4、SLA－2、SLA－3、SLA－9、SLA－5 和 SLA－1，其 中SLA－1、－2、－3是功能性基因，其他的4个经典的SLAⅠ类基因是假基因。在Ⅰ类区有3个非经典的SLAⅠ类基因（SLA－6、SLA－7、SLA－8），它们位于Ⅰ类区的着丝粒末端。与人MHCⅠ系统相似，在SLAⅠ区也存在MHCⅠ链相关基因（MHC classⅠchain－related genes，MIC），包括 MIC－1和 MIC－2，MIC－2预测是功能性的，MIC－1是假基因［5］，在SLAⅢ类区同Ⅰ类区相连，并更靠近着丝粒，在这个区域有超过60个基因座被鉴定，其中有许多在免疫防御中起重要作用的基因，例如肿瘤坏死因子家族成员（TNF、LTA和LTB）和补体成份（C2、C4A 和 CFB）［3，6］。

在SLAⅡ类区，有几个基因座编码表达SLAⅡ类抗原，它们编码表达SLA－DR、DQ、DM和DO分子的α链和β链，最靠近着丝粒是SLA－DRA基因，接着是SLA－DRB1、DQA、DQB1、DOB1、DMB、DMA和DOA。SLAⅡ类假基因有SLA－DRB2、DRB3、DRB4、DRB5、DQB2、DOB2和wDYB。同人的MHCⅡ系统相似，猪抗原递呈相关基因，例如TAP基因（TAP1和TAP2）和蛋白酶体β亚单位基因（PSMB8和PSMB9，旧称LMP7和LMP2），定位在DOB1和DMB基因座之间［5－7］（图1）。

2 SLA的基因结构与分子功能

经典的SLAⅠ基因由8个外显子组成，外显子1编码前导序列，外显子2－4编码相应的α1、α2和α3功能区，外显子5编码跨膜区，外显子6－8编码胞内区。所有表达的经典SLAⅠ在编码区高度相似，SLA－1和SLA－3的非翻译区也非常相似，同它们相比，SLA－2的前导序列长9bp。非经典的SLAⅠ基因结构与经典的SLAⅠ基因相似，不同之处是其胞内区由2个外显子编码［8］。SLAⅡ的α链基因由4个外显子组成，外显子1编码前导序列，外显子2、3分别编码α1、α2功能区，外显子4编码跨膜区和胞内区。同α链相比，SLAⅡ的β链分子基因结构与之基本相同，SLA－DQB1在胞内区多1个编码外显子，SLA－DRB1在胞内区多2个编码外显子［9］（图2）。研究发现SLA－DQB基因的外显子2存在高度多态性，这种多态性与Ⅱ类抗原的生物学特性有着密切的关系［10］。

猪β2m基因定位于1号染色体。经典的功能性SLAⅠ分子由重链（α链）和轻链（β2m）组成，它们表达于所有有核细胞的表面，主要功能是递呈内源性抗原多肽给CD8＋T细胞。它们也与自然杀伤性细胞（natural killer，NK）相互作用，阻止NK细胞介导的细胞毒性［11］。已有的研究提示，在猪体内SLA－1表达水平最高，SLA－2次之，SLA－3表达水平最低［5］。非经典的SLAⅠ分子和MIC分子的功能还需要进一步研究确定。表达的SLAⅡ抗原（SLA－DR、SLA－DQ）发现主要分布于专业的抗原递呈细胞（antigen presenting cell，APC）上，例如巨噬细胞、B细胞、树突状细胞［12］；它们在各种毛细血管的内皮细胞上的表达也有报道；意料之外的是，T细胞表达SLAⅡ抗原，并且优先表达在CD8＋T细胞上；另外，在CD2＋CD8＋γδT细胞也发现有SLAⅡ抗原的表达。SLAⅡ抗原主要功能是递呈外源性抗原多肽给CD4＋T细胞［7］。

图1 SLAⅠ、SLAⅡ和SLAⅢ类区域基因物理图谱Fig.1 Physical map of SLAⅠ，SLAⅡand SLAⅢgenes

图2 SLA基因的分子构成示意图Fig.2 Schematic molecular organization of the SLA genes.

3 SLA基因的多态性

到目前为止，在免疫多态性数据库（immunopolymorphism database，IPD）的 SLA 序 列 库 （http：／／www.ebi.ac.uk／ipd／mhc／sla／）中，有116条已经鉴定的经典的SLAⅠ等位基因，另外还有13条非经典的SLAⅠ等位基因，分析发现，SLA－1、SLA－2、SLA－3基因具有高度的多态性。在这些鉴定的SLAⅠ基因中，44条SLA－1基因可分为12个等位基因组，26条SLA－3基因和46条SLA－2基因则分别可分为7和14个等位基因组。而SLAⅠ基因的高度多态性主要集中在外显子2和3，它们编码的SLAⅠ重链的α1和α2功能区形成抗原肽结合槽。另外，还发现几个SLAⅠ等位基因的长度存在差异，目前还不知道这种长度变化会不会影响表达蛋白的完整性，从而改变它们的表面表达。非经典的SLA－6、SLA－7和SLA－8已经鉴定的等位基因分别有9、2和2个，在这9个SLA－6等位基因之间，仅存在非常少的核甘酸差异，另外2个SLA－7有8个核甘酸位点的不同，2个SLA－8有7个核甘酸位点的不同。在IPD－MHC SLA序列库，有164条已经鉴定的经典的SLAⅡ等位基因，其中α链和β链的等位基因分别有38条（13DRA、20DQA和5DMA）和126条（82DRB1和44 DQB1）［13］。

4 SLA限制性T细胞抗原表位分析

有关SLA限制性T细胞抗原表位的鉴定及应用研究已有近20年的历史，结果是以不同的方法、在不同层次上获取一些病原的T细胞抗原表位信息。Pauly T等［14］通过合成一系列来源猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）的重叠肽，鉴定出一条SLAⅠ限制性细胞毒性T细胞（cytotoxic T－lymphocyte，CTL）细胞表位（氨基酸序列为ENALLVALF），虽然不知道该序列的具体的限制性SLAⅠ基因，但知道该SLAⅠ基因来自 MHC单倍型为d／d（Hp－4a.0）的NIH小型猪。Ramachandran S等［15］通过酸洗脱的方法，从猪的主动脉细胞上获得了一些SLAⅠ分子结合的猪内生性逆转录病毒（Porcine endogenous retroviruses，PERV）的来源多肽，研究证实有两条多肽能够有效引起人的CTL细胞的反应。Gao F S等［16］合成的两个来源猪口蹄疫病毒（Foot－and－mouth disease virus，FMDV）VP1蛋白的9肽，氨基酸序列分别为RRQHTDVSF和RTLPTSFNY，这两个多肽能够与SLA－2－（G4S）3－β2m单链复合体蛋白结合，并能使免疫小鼠产生CD8＋T细胞的反应。Molder T等［17］用艾滋病病毒（HIV－1）DNA疫苗接种猪，免疫结束后，分离外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC），用合成的HIV－1多肽刺激，发现一些能够引起IFN－γ分泌增加的多肽，它们在HIV－1的位置与已鉴定的人MHCⅠ限制的HIV－1表位基本相同。Díaz I等［18］利 用 MAPPP 网 站 （http：／／www.mpiib－berlin.mpg.de／MAPPP／binding.html）预测合成了一些猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）来源多肽，用PRRSV－LV株弱毒疫苗免疫长白猪后，分离PBMC，加入合成的多肽刺激，通过检测IFN－γ产生情况，确定了5条SLAⅠ限制性多肽和3条SLAⅡ限制性 多 肽。Hoof I等［19］利 用 NetMHCpan（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetMHCpan／）预测并鉴定了13条能够结合于SLA－1＊0401的多肽，并且SLA－1＊0401对其中5条多肽有强的结合性。

5 SLA分子的结构研究

SLA分子三维结构的解析，将有助于阐明SLAⅠ或SLAⅡ与多肽的结合规律，了解病原的SLA限制性T细胞免疫应答的特征和分子基础，目前这方面的研究较少，并且主要集中在SLAⅠ类分子上。Oleksiewicz M B等［20］开始了体外构建猪SLAⅠ复合物分子的尝试，他们用连接肽将SLAⅠ分子的重链、β2m和病毒多肽连接成一条单链，证实了该单链复合体能够在体外正确的折叠。Gao F S等［21－22］用一个富含甘氨酸和丝氨酸的linker（G4S）3，采用剪接延伸PCR（splicing overlap extention PCR，SOE PCR）法，将巴马小型猪SLA－2的胞外区和β2m成熟肽基因相连成基因链SLA－2－（G4S）3－β2m，将SLA－2的胞外区、β2m成熟肽基因和 SLA－2－（G4S）3－β2m 分别插入 pMAL－p2X质粒进行可溶性表达，得到的蛋白经Amylose树脂亲和层析、Factor Xa蛋白酶切、DEAE糖分子筛进行分离和纯化，纯化的SLA－2、β2m和SLA－2－（G4S）3－β2m蛋白采用圆二色谱（SD）测定它们的二级结构（2D），并在此基础上，同源模建了巴马小型猪SLA－2和β2m蛋白的三级结构（3D）。

潘孝成等［23－24］首次报道了 SLAⅠ分子（SLA－1＊1502）与来自PRRSV来源多肽（NSP9TY9）复合物三维晶体结构的解析，解析的结构表明，其整体结构与已解析的人及其他动物的MHCⅠ类分子结构相似，且多肽结合的锚定残基也为多见的P2位和Pc位氨基酸。同其他MHCⅠ类分子相比，SLA－1＊1502的多肽结合槽有一个大的B口袋，使该口袋可容纳的氨基酸种类增加，依靠这个基础，相比于对结合多肽有更多挑剔的MHCⅠ分子，SLA－1＊1502有更多的机会去限制性结合关键性的抗原表位多肽。另外潘孝成等还解 析 了 SLA－1＊1502、鼠 β2m（mβ2m）和 多 肽NSP9TY9复合物的三维晶体结构，发现这两个SLA－1＊1502的结构中，SLA－1＊1502的主链碳原子（Cα）构象在实验误差的范围内相同，且mβ2m和猪β2m（sβ2m）与SLA－1＊1502形成氢键的氨基酸高度保守。这方面的研究为将SLAⅠ转入鼠中开展相关的免疫学研究奠定基础。同年，张念之等［25－26］解析了SLAⅠ分子（SLA－1＊0401）与来自流感病毒及埃博拉病毒的多肽（S－OIVNW9、EbolaAY9）复合物结构，SLA－1＊0401分子的突出特点是位于D口袋的156位精氨酸（Arg156）具有对多肽结合的“否定权”。Arg156的侧链以不同的方式分别结合多肽S－OIVNW9、EbolaAY9，并造成了两个结构中C、D口袋构象的改变。突变体SLA－1＊0401－H－Ala156扩 大 了 多 肽 结 合 谱，证 明Arg156在多肽结合中起限制性作用。

6 展望

目前，有关猪SLA的研究主要集中在基因的克隆、序列多态性分析、基因组结构、染色体定位以及其在抗感染和疫苗反应中的所充当的角色等方面，而涉及SLA分子与抗原表位多肽的结合方式及作用机理等方面研究则相对较少。2011年两个SLAⅠ分子晶体结构的解析将有助于阐明SLAⅠ与多肽的结合规律，了解SLAⅠ限制性CTL免疫应答的特征和分子基础。当前SLA研究应该聚焦于深入探究具体SLA等位基因在控制免疫反应中的角色、测定感染和免疫后所产生的具体抗原表位以及定量分析抗原特异性T淋巴细胞等方面。

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