Sf9昆虫细胞悬浮培养工艺研究

李 伟，秦红刚，张 萍，漆世华，朱 薇，王 威，谢红玲，温文生，吴玉石

(武汉中博生物股份有限公司，武汉 430070)

昆虫细胞杆状病毒表达系统是20世纪80年代发展起来的新型表达载体系统，据报道现已成功应用于500多种外源蛋白的表达［1］。相比贴壁依附型的哺乳动物细胞，昆虫细胞可直接进行悬浮培养而更具有优越性。不同昆虫细胞系在不同培养基中的生长动力学及代谢参数已有文献报道［2］。理论及实验表明，利用重组杆状病毒感染高密度的Sf9细胞可获得高水平的外源蛋白的表达［3］。本文对Sf9细胞在Sf900Ⅱ无血清培养基和仅添加10%血清的Grace基础培养基中的生长情况进行了比较，同时利用Sf900Ⅱ无血清培养基从摇瓶放大到14 L搅拌式生物反应器对培养工艺做了研究，为昆虫细胞的大规模高密度培养打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 Sf9昆虫细胞由美国 Newport＆Prota tek公司惠赠，经摇瓶悬浮培养驯化所得。

1.1.2 培养基及试剂 Sf900Ⅱ无血清培养基及添加剂PF68、Grace基础培养基均购自Gibco公司;小牛血清购自武汉三利生物技术有限公司;葡萄糖、氨、乳酸、谷氨酰胺及总氨基酸检测试剂盒购自南京建成科技有限公司。

1.1.3 实验设备 细胞培养摇床为上海智诚分析仪器制造有限公司;分光光度计为上海尤尼柯2100可见分光光度计;生物反应器为荷兰Applikon 14L搅拌式生物反应器。

1.2 方法

1.2.1 细胞监测 细胞通过血球计数板来计数，经台盼蓝染色来测定细胞活性。

1.2.2 生化分析 葡萄糖、氨、乳酸、谷氨酰胺及总氨基酸的测定严格按相关试剂盒说明书进行，结果在紫外可见光分光光度计上测得。

1.2.3 Sf9细胞摇瓶悬浮培养 细胞经克氏瓶静止培养复苏后，以传代后初始密度不低于每毫升2.5×105的接种量逐步放大到250 mL摇瓶，摇瓶装液体积为50～100 mL，要求细胞生长密度不高于5×106/mL时进行传代。Sf900Ⅱ无血清培养基中添加0.1%的 Pluronic F68，Grace培养基中添加10%的小牛血清，培养温度27～30℃，摇床转速100～120 r/min。

1.2.4 Sf9细胞生物反应器悬浮培养 将摇瓶种子细胞逐步扩大培养后，按接种生物反应器细胞初始密度不低于2.5×105/mL的接种量接种。培养基中加入0.1%的Pluronic F68，采用Vortex搅拌浆微泡通气模式，培养温度27～30℃，搅拌转速150～200 r/min，DO控制在50% ～80%。

2 结果与分析

2.1 Sf900Ⅱ无血清培养基摇瓶悬浮培养 Sf9细胞在250 mL摇瓶中培养的生长曲线见图1。细胞初始密度为2.8×105/mL，接种细胞后4～16 h细胞生长处于静止期，16～28 h细胞开始逐步适应开始快速生长，28～88 h细胞处于对数生长阶段，此时细胞生长不受限制，细胞比生长速率为0.032/h(图2)，倍增时间为20 h，且对数生长期可维持60 h以上。整个培养过程细胞活性在90%以上，细胞分散良好。

2.2 Grace培养基添加有10%血清摇瓶悬浮培养将无血清培养基悬浮培养的Sf9细胞悬液离心后重悬于添加10%小牛血清的Grace基本培养基中，适应培养48 h后传代，接种250 mL摇瓶，细胞摇瓶培养生长情况如图3。初始细胞密度为4.3×105/mL，细胞比生长速率不高于0.02/h，计数细胞倍增时间约为37 h，且细胞生长状态不是很好，继续传代培养发现细胞几乎不生长，细胞形态呈梭状。尝试在培养基中添加0.5%的Pluronic F68，效果依然没有改善。可见添加有10%血清的Grace基础培养基相比无血清Sf900Ⅱ培养基效果要差。有文献报道在培养基中添加酵母水解物和乳清蛋白水解物Sf9细胞生长良好［4］。

图3 Sf9细胞Grace培养基细胞生长曲线

2.3 Sf900Ⅱ无血清培养基添加1%血清悬浮培养血清有促进细胞生长性能且对细胞生长有剪切保护的作用［5］。为进一步提高Sf9细胞活性及生长速率，尝试在Sf900Ⅱ无血清培养基中添加1%的小牛血清考察其生长情况，同时设Sf900Ⅱ无血清培养基作对照。细胞培养60 h后传代，情况如图4所示。可以看出，血清的加入对细胞生长速率及细胞活性的提高有一定的影响，传代培养60 h细胞生长密度提高30%，细胞活性提高3%。可见添加牛血清对细胞生长及活性提高有比较显著的促进作用，但产品的质量风险也随之增加。

图4 Sf9细胞无血清培养基与添加1%血清生长对照

2.4 搅拌式生物反应器Sf900Ⅱ无血清悬浮培养为了扩大培养规模，尝试用生物反应器培养Sf9细胞，种子细胞来源于摇瓶悬浮培养。摇瓶培养细胞扩大到一定体积后接种生物反应器，初始细胞密度不低于2.5×105/mL，每隔12 h取样计数并作检测，结果如图5－图10所示。图5显示，细胞在前36 h生长缓慢，可能与接种细胞密度低有关;细胞培养120 h达到最高细胞密度1.4×107/mL，这时细胞活性显著下降到80%以下，取样观察此时细胞有部分结团现象。有报道称，乳酸的积累可能是引起细胞结团的重要原因［6］。整个培养过程，葡萄糖作为最重要的碳源，其总的消耗量约为初始含量的3/4(图6)，谷氨酰胺作为主要的氮源物质变化不明显(图7)。细胞培养后期，副产物乳酸和氨积累较为明显(图8、图9)，这可能是引起细胞活性降低的重要原因之一。整个过程中，培养基中总氨基酸的消耗量不足初始总氨基酸含量的1/4(图10)，主要氨基酸的耗尽也会严重影响细胞的生长［7］。

3 讨论

3.1 随着生物技术的发展，利用无血清低蛋白培养基生产蛋白类药物是生物技术产业的发展方向。利用Sf900Ⅱ无血清培养基培养Sf9昆虫细胞具有细胞密度高，培养基成分明确，且易于大规模悬浮培养等具有更好的应用前景。

3.2 血清对细胞生长有一定的保护作用，可明显提高细胞的活性，本文也从实验中验证了这一观点。但随后的实验也发现，随着细胞在无血清培养基中的不断适应培养和传代，血清对细胞活性的改善不明显。

3.3 动物细胞的大规模培养是其工业化的前提。利用生物反应器培养Sf9细胞可获得较高的细胞密度，但后期细胞活性明显下降，分析原因如下:

①气泡。生物反应器培养后期细胞密度比较高，为了满足溶氧需求，过程需增大通气量，故而会形成较多的气泡，而气泡破裂形成的张力对细胞剪切损伤比较大［8］。

②搅拌。无血清培养基培养的细胞对搅拌敏感性较添加了血清培养的更高。

③营养物质的限制和代谢副产物的积累。培养过程中总的氨基酸的消耗，特别是主要氨基酸的消耗可能会限制细胞生长，代谢副产物如乳酸、氨的积累过多会对细胞产生毒性，对细胞的生长有比较大的抑制作用。

④渗透压。细胞生长有一个适宜的渗透压范围，随着后期代谢产酸，培养液中渗透压会随之升高，引起细胞活性水分子的流失，是培养后期细胞活性降低的一个重要原因。通过不断优化培养工艺条件，如改变通气和搅拌方式，设计个性化培养基，调整培养方式及补料策略等来改善细胞活性有待进一步研究，为今后利用昆虫杆状病毒系统工业化生产蛋白类药物打下基础。

［1］Miller L K.High level expression in insect cells［J］.Curr Opin Genet Dev，1993，3:97 －101.

［2］Ikonomou L，Schneider Y J，Agathos S N.Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2003，62:1 －20.

［3］Chiou T W，Hsieh Y C，Ho C S.High density culture of insect cells using rational medium design and feeding strategy［J］.Bioprocess Engineering，2000，22:483 －491.

［4］张宝珠.昆虫细胞(Sf9)无血清培养的研究［J］.实验室科学，2005，10(5):53 －55.

［5］金小红，孟哲峰，陈存国.小牛血清和胎牛血清对Sf9细胞生长和重组蛋白表达影响的比较［J］.中国病理生理杂志，2006，22(2):415 －416.

［6］Ikonomou L，Bastin G，Schneider Y J，et al.Design of an efficient medium for insect cell growth and recombinant protein production in vitro cell［J］.Dev Biol Animal，2001，37:549 －559.

［7］Ikonomou L，Schneider Y J，Agathos S N.Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2003，62:1 －20.

［8］James D M，Jason E N，Ameet K M，et al.Analysis of cell－ to －bubble attachment in sparged bioreactors in the presence of cellprotecting additives［J］.Biotechnology and Bioengineering，1995，47:407－419.