链霉素抗性突变选育那西肽高产菌株

高自召

(浙江赐富医药有限公司，浙江绍兴 312030)

那西肽是一种含硫多肽类抗生素，英文名Nosiheptide，是一种比较理想的饲用抗生素换代品。那西肽最先由罗纳普朗克公司进行研究和试生产，但由于其产量低，成本太高而未能大规模推广。直到80年代，开始规模化生产。虽然之后通过育种及工艺优化工作的持续开展，其菌种水平有了很大的提高，但菌种产量尚存在很大的提升空间。那西肽主要由活跃链霉菌(Streptomyces actuosus)、抗生素链霉(S.antibiotics)和青灰色链霉菌(S.glaucogriseus)产生，其中以活跃链霉菌为最好［1］。在此，对那西肽产生菌出发菌株N106的孢子进行抗链霉素致死剂量测定，采用紫外对出发菌株孢子进行诱变处理，使诱变孢子的DNA产生高频率突变，然后将突变的孢子涂布在含有链霉素最低抑制浓度的培养基平板上进行培养，获得链霉素抗性基因(str)突变高产菌株 NUS146、NUS182。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 那西肽产生菌N106菌株，本室保存。

1.1.2 培养基 斜面和平板培养基:可溶性淀粉、牛肉膏、硫酸铵、硫酸镁、磷酸氢二钾等，pH 7.2～7.4，去离子水配制。种子培养基:淀粉、黄豆饼粉、酵母粉、硫酸铵等，pH 7.2 ～7.4，饮用水配制。发酵培养基:淀粉、黄豆饼粉、硝酸钠、硫酸镁等，pH 7.0 ～7.5，饮用水配制。

1.1.3 硫酸链霉素 大连医药集团大连制药厂。

1.1.4 原料和试剂 玉米浆、玉米粉、玉米淀粉、黄豆饼粉、酵母粉等均购自市场。可溶性淀粉(分析纯)、NaNO3(分析纯)、MgSO4(分析纯)、(NH4)2SO4(分析纯)、K2HPO4(分析纯)、N，N － 二甲基甲酰胺(分析纯)、乙醇(分析纯)等。

1.1.5 仪器 Waters高效液相色谱仪、生物效价测量仪、摇床等。

1.2 方法

1.2.1 制备单孢子悬液 取N106菌株新鲜斜面，用无菌水制成孢子悬液，脱脂棉过滤，收集单孢子悬液，用血球计数法计数，调整浓度为108/mL。

1.2.2 链霉素对N106菌株孢子的最低抑制浓度的测定 将制备好的出发菌株的孢子悬液涂布在含不同浓度(u/mL)链霉素的那西肽固体平板上，28℃下培养7 d，观察平板上的菌落数，凡是在前一个低浓度平板上已长出菌落，而在后一个较高浓度平板上未长出菌落的，后一浓度即为抗生素对出发菌株的孢子的最低致死浓度，即最低抑制浓度［2］。此试验需要先进行预试验，大致确定链霉素最低抑制浓度范围后，再进行浓度范围设置及正式试验，最终确定最低抑制浓度。每次试验条件应保持一致，如每次涂布于链霉素平板上的孢子悬液中孢子数量应保持在一个数量级。

1.2.3 紫外诱变最适剂量的确定 取5 mL浓度为108个/mL的孢子悬液于培养皿中，置紫外诱变箱(紫外灯功率15 W，253.7 nm，照射距离30 cm)中搅拌诱变，时间分别为 0(对照)、20、30、40、60、80、100 s，稀释涂皿，28 ℃避光培养7 d。

1.2.4 链霉素抗性突变株的制备 将经过紫外诱变的孢子悬液按0.1 mL/皿的加量涂布于含最小抑制浓度的链霉素培养基平板上，28℃避光培养7 d，生长出的菌落即为链霉素抗性突变株。

1.2.5 抗性突变株的斜面制备 将单菌落接种于那西肽试管斜面培养基上，28℃避光培养7 d，保存于冷藏冰箱，待摇瓶发酵试验。

1.2.6 抗性突变株的摇瓶发酵实验 斜面接种于装有50 mL种子培养基的500 mL三角瓶中，28℃200 r/min旋转式摇床培养46～48 h，然后以5%的接种量接种到装有50 mL发酵液的500 mL三角瓶中，28℃ 200 r/min，旋转式摇床发酵160～168 h。

1.2.7 那西肽含量的测定 用生物效价检测法进行发酵液中那西肽含量检测。

1.2.8 那西肽组分分析 使用Waters高效液相色谱仪对高产菌株与对照出发菌株发酵液进行那西肽组分分析，以确定高产菌株产生的抗生素成分。HPLC色谱条件:250 mm×4.6 mm C18反相柱，检测波长254 nm，进样量10 μL，流速1 mL/min，流动相为乙腈(含 0.1%TFA)、水(含 0.025% 磷酸)(50∶50)。标准品及样品溶液制备:那西肽标准品用DMF溶解，配成1000 u/mL溶液;高产菌株发酵液用DMF浸提，浸提完成后取滤液用DMF稀释成约含那西肽1000 u/mL的溶液。

1.2.9 抗性突变株的稳定性研究 通过菌株传代，检测不同代数菌株的发酵目标代谢产物含量有无明显变化，以判断突变菌株的稳定性。

2 结果与分析

2.1 链霉素最低抑制浓度的测定 预试验设计6个链霉素梯度浓度，分别为 0、0.5、1、5、10、50 u/mL，结果在链霉素浓度为5～50 u/mL的培养基上未长菌落。由此可知，链霉素对那西肽出发菌种N106的最小致死浓度小于5 u/mL。据此，将0～5 u/mL 再细分为0.5、1、2、3、4、5 共 6 个链霉素梯度浓度再次进行试验。两次试验结果见表1。

表1 那西肽产生菌在不同浓度链霉素平板上的致死率统计表

由表1可知，那西肽产生菌出发菌株对链霉素极度敏感，低剂量的链霉素就能使死亡率达到90%以上。随着链霉素浓度的增加，出发菌株在筛选平板上的单菌落逐渐减少，当链霉素浓度为1 u/mL时，菌落生长就受到很大影响，生长变慢，明显小于对照，并出现一些全秃或半秃的菌落。当链霉素浓度达到3 u/mL时，筛选平板上无单菌落形成，故链霉素对N106菌株的最小抑制剂量为3 u/mL。

2.2 紫外致死曲线的绘制 紫外照射剂量与致死率之间在一定范围内存在明显的剂量效应关系见图1。

图1 紫外线照射N106致死率曲线图

由图1可以看出，随着照射时间的延长，致死率逐渐升高，当照射时间超过60 s时，致死率达到90%以上。一般认为杀菌率以90.0% ～99.9%效果较好，但也有报道认为，较低的杀菌率有利于正突变菌株的产生［3］。因此，本次试验选用致死率达到90%但并非最高的60 s作为紫外线诱变剂量。

2.3 链霉素抗性突变株的筛选 通过紫外诱变及链霉素抗性筛选，在链霉素浓度为3 u/mL的筛选培养基平板上分离得到213株抗性菌株，经单菌落发酵初筛后有26株效价高于出发菌株。将初筛效价高的单菌落移植斜面，经过两次摇瓶发酵，用生物效价检测方法测定那西肽抗性菌株效价。两次复筛效价均值结果见表2。

表2 那西肽抗性菌株复筛效价均值统计 u/mL

可以看出，本次利用链霉素抗性基因突变筛选法获得摇瓶发酵效价达3000 u/mL以上的高产菌株共有8株，约占抗性菌株的4%，最高产量菌株NUS182效价较出发菌株效价提高37.97%。

2.4 高产菌株的发酵产物研究 两个高产菌株NUS182、NUS143与对照菌株N106在同样工艺条件下，同时进行摇瓶发酵，发酵液进行HPLC检测(图2)。由HPLC图谱可以看出，以上获得的高产菌株NUS182、NUS143产生的那西肽图谱与对照菌种一致，说明诱变菌株NUS182、NUS143效价水平的提高是那西肽产量增加所致。

图2 高产菌种NUS182、NUS143与对照菌种N106摇甁发酵液HPLC图谱

2.5 高产菌株稳定性研究

2.5.1 高产菌株传代试验 取 NUS146、NUS182菌株的孢子甘油冻存管，将冻存孢子转接至试管斜面培养上，28℃培养7 d后作为F1代，从F1代斜面转接斜面后F1代冰箱保存，同样28℃培养7 d为F2代，同样方式接连传代到F4，然后分别将F1、F2、F3、F4斜面同时转接斜面扩大培养，28℃培养7 d，即为 F2、F3、F4、F5代。

2.5.2 传代菌株的摇瓶发酵 取上述分别培养了7 d 的 F2、F3、F4、F5代孢子斜面，铲块(相同大小的菌块)接种到种子培养基中28℃培养2 d，然后转接到发酵培养基中进行摇瓶发酵，28℃培养7 d。重复试验3批，平均效价及相对于F2代的效价增减幅度均值统计情况见表3。

表3 那西肽抗性高产菌株发酵水平验证

由表3可知，高产突变株NUS146及NUS182均表现为:F3～F4代高产性能相对稳定，F5代产量分别下降了14.98%、13.03%，生产上不可行，故该菌种作为生产菌种使用时，应注意最多传至4代，传代过多，生产水平具有下降的风险。

3 讨论

3.1 链霉菌产抗生素能力与链霉素抗性基因之间的对应关系是抗生素科研领域的一个研究热点［4］，用链霉素作为致死抗药性突变标志定向筛选诱变后的菌株，有一定的方向性，能极大地提高筛选效率。

3.2 紫外诱变是工业生产中最常用的诱变方法之一，但由于该方法所致的发生变异的不定向性与筛选的盲目性，往往筛选工作量大而且效果不佳。本文将传统诱变方法筛选那西肽产生菌突变株结合链霉素抗性筛选法，在增大突变率的同时，又提高突变菌株的正变率达到12.21%，并筛选到了几株高产菌株，表明对那西肽菌种诱变后以链霉素抗性作为筛选模型对那西肽菌种水平的提高十分有效。

3.3 在此基础上，可复合链霉素筛选模型对那西肽菌种进行其他理化因子的诱变尝试。另外，本研究对其他链霉菌品种的高效育种也有一定的借鉴意义。

［1］李红军，邹晓庭.一种新型饲料添加剂［J］.饲料研究，2004，2:17.

［2］江 凌，邬建国，陈伟伟，等.链霉素抗性突变－万古霉素高产菌株的选育研究［J］.中国抗生素杂志，2005，30(2):70 －71.

［3］施巧琴，吴松刚.工业微生物育种学［M］.北京:科学出版社，2009:38.

［4］杨东靖，陈冠群，陈 巍，等.链霉素抗性突变—纳他霉素高产菌株的选育研究［J］.微生物学通报，2003，30(4):31.