鸡蛋和牛奶中噁喹酸、氟甲喹残留的检测方法研究

李 倩，张玉洁，王鹤佳，仲 锋，徐秉恩

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

噁喹酸和氟甲喹是第二代喹诺酮类药物，其抗菌谱广，杀菌力强，吸收快，对治疗革兰氏阴性菌感染，特别是对大肠杆菌、支原体、嗜水气单胞菌引起的畜、禽及水生动物疾病有较好疗效［1－2］。本类药物一般毒性较低，安全范围大。但随着噁喹酸和氟甲喹在兽医临床上的广泛应用，其产生的毒副作用仍会对人体产生直接的危害，因此其在可食性动物组织中的残留问题已经日益引起人们的关注。农业部于2002年发布的第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定:噁喹酸在鸡蛋中的最高残留限量为50 μg/kg，氟甲喹在奶中的最高残留限量为50 μg/kg。有关噁喹酸、氟甲喹在动物性产品残留检测方法的文献报道较多，主要是高效液相色谱法［3－4］，且多用于测定各类鱼［5－6］、虾组织中的残留量。测定鸡蛋和牛奶中的这两种药物残留还未见报道。本研究旨在建立一种同时检测两种药物在鸡蛋和牛奶中残留量的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器和设备 Agilent1100高效液相色谱仪(配荧光检测器和二元梯度洗脱系统)C18色谱柱;保护柱;分析天平:感量0.00001 g;天平:感量0.01 g;组织匀浆机;涡旋混合仪;振荡器;高速离心机;旋转蒸发仪。

1.2 试剂和溶液 噁喹酸标准品(含量≥98.0%);氟甲喹标准品(含量≥99.0%);氢氧化钠、甲酸、磷酸均为分析纯;四氢呋喃、乙腈、正丙醇均为色谱纯;水为去离子水。

噁喹酸和氟甲喹标准储备液:精密称取噁喹酸、氟甲喹标准品各约10 mg于10 mL量瓶中，用0.03 mol/L氢氧化钠溶液溶解并稀释成浓度为1 mg/mL的标准储备液。

噁喹酸和氟甲喹标准工作液:准确量取适量噁喹酸和氟甲喹标准储备液，用乙腈稀释成适宜浓度的噁喹酸和氟甲喹标准工作液。

5.0 mol/L氢氧化钠溶液:取氢氧化钠饱和液28 mL，加水稀释至100 mL。

0.03 mol/L氢氧化钠溶液:取5.0 mol/L氢氧化钠液0.6 mL，加水稀释至100 mL。

0.02 mol/L 磷酸溶液:取 85%磷酸 1.36 mL，加水稀释至1000 mL。

1%甲酸乙腈溶液:取98%甲酸10 mL，加乙腈稀释至1000 mL。

1.3 色谱条件 流动相:0.02 mol/L磷酸溶液－乙腈－四氢呋喃(68∶16∶16);检测波长:激发波长325 nm，发射波长369 nm;柱温30℃;流速0.8 mL/min;进样量 20 μL。

1.4 标准曲线的绘制 精密量取适量噁喹酸和氟甲喹标准工作液，用流动相稀释成浓度为3、10、50、100、300、500 ng/mL 的系列溶液。

1.5 样品的提取 称取(2±0.05)g试料，置50 mL离心管中，加1%甲酸乙腈溶液6 mL，涡旋混匀，中速振荡5 min，10000 r/min离心5 min，上清液转入50 mL鸡心瓶中，重复提取一遍，合并两次上清液，加正丙醇3 mL，50～55℃减压浓缩至干。浓缩物用流动相2.0 mL溶解，混匀后转入5 mL离心管中，8000 r/min离心5 min，取上清液过滤膜后作为试样溶液，供高效液相色谱分析。

2 结果

2.1 标准曲线的测定 将绘制标准曲线用对照溶液依次从低浓度到高浓度，按液相色谱条件进行分析。每一浓度进样3针，按其所得峰面积的平均值与对应的对照溶液浓度作标准曲线图(图1)，并计算回归方程及相关系数。噁喹酸和氟甲喹的线性浓度范围为3～500 ng/mL，标准曲线方程分别为噁喹酸 y=0.0504x －0.0943，相关系数 r=0.9992;氟甲喹 y=0.0602x －0.1549，相关系数 r=0.9991。

图1 噁喹酸、氟甲喹标准曲线图

2.2 方法精密度和准确度 分别取鸡蛋和牛奶(2±0.05)g，加适量的标准溶液，制成含噁喹酸和氟甲喹浓度为10～100 ng/g的添加样品，按1.5项下提取处理后进行色谱分析。噁喹酸和氟甲喹标准、空白鸡蛋及添加色谱图见图2－图4。取峰面积值计算噁喹酸、氟甲喹的含量，以测得量和加入量之比计算回收率。按照农业部第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》要求，分别测定包括最高残留限量在内的3种浓度，按每个浓度各测5个样品的回收率计算批内相对标准偏差，每个浓度各测3批计算批间相对标准偏差。结果(表1和表2)表明，方法中噁喹酸和氟甲喹在 10、50、100 ng/g添加水平的平均回收率在73% ～94%之间，批内相对标准偏差小于8%，批间相对标准偏差小于12%，结果重复性好，回收率高，方法的准确度和精密度可以满足残留检测的要求。

表1 鸡蛋中噁喹酸和氟甲喹回收率及批内批间相对标准偏差测定结果

表2 牛奶中噁喹酸和氟甲喹回收率及批内批间相对标准偏差测定结果

2.3 方法灵敏度 空白试料按提取方法处理后进行色谱分析，在相应的保留时间处，空白试料对所测分析物无干扰。在鸡蛋和牛奶中添加标准溶液，使其在组织中的添加浓度分别为3、5和10 μg/kg。按照1.5项下提取净化方法处理后，经HPLC检测。测定结果显示，添加浓度为5 μg/kg时，药物的信噪比(S/N)约等于3，添加浓度为10 μg/kg时，信噪比均＞10，为此，确定噁喹酸、氟甲喹在鸡蛋和牛奶中的检测限为5 μg/kg，定量限为10 μg/kg。

3 讨论

液—固相萃取是常用的提取、净化方式，动物性组织中噁喹酸、氟甲喹残留检测主要采用液—固相萃取的提取、净化方法［7］，考虑到鸡蛋和牛奶中杂质较少，基质比较干净，因此实验采用液—液萃取方法，省略用固相萃取的净化的方法，既节省了实验的成本，同样达到了较为理想的色谱分离。

鸡蛋和牛奶样品一般含脂量较高。在实验提取过程中加入正己烷进行除脂，但提取的结果与未加正己烷除脂的相比较，无明显差别，因此仅使用1%甲酸乙腈提取，不加正己烷除脂，减压浓缩的处理方法即可满足检测要求，并具有成本低、样品处理速度快的特点。

本实验采用高效液相色谱荧光检测器检测，建立了噁喹酸、氟甲喹在鸡蛋和牛奶中的残留检测方法，具有操作简便、节省有机溶剂减少对环境的污染等特点。其方法的灵敏度、准确度及精密度均达到了兽药残留检测方法的要求，适用于实际样品的检测。

［1］沈建忠，谢联金.兽医药理学［M］.北京:中国农业大学出版社，2000:162 －167.

［2］杨永胜，闺章年.国内鱼因抗菌药物的现状与展望［J］.中国兽药杂志，1997，31(2):51 －54.

［3］Pouliquen H，Morvan M L.Determination of residues of oxolinic acid and flumequine in freeze－dried salmon muscle and skin by HPLC with fluorescencedetection［J］.Food Additives ＆Contaminants:Part A，2002，19(3):223 －231.

［4］Germain Carignan，Lyse Larocque，Stephen Sved.Assay oxolinic acid residues in salmon muscle by chromatography with fluorescence detection:Interlaboratory study［J］.Association of official Analytical Chemists，1991，74(6):906 －909.

［5］仲 锋，董琳琳，汪 霞.噁喹酸、氟甲喹在鱼组织中残留量的检测方法研究［J］.中国兽药杂志，2002，36(11):20 －22.

［6］刘艳萍，冷凯良，王清印，等.高效液相色谱法测定鳗鱼中氟甲喹和噁喹酸的残留量［J］.上海海洋大学学报，2009，18(3):332－337.

［7］仲 锋，汪 霞，董琳琳，等.噁喹酸、氟甲喹在鸡组织中残留量的检测方法研究［J］.中国兽药杂志，2002，36(9):19 －21.