HPLC－PDA法同时测定黄芪多糖注射液中非法添加的四种解热镇痛类药物

郝利华，于晓辉，董玲玲，万仁玲，宋 洋

(1.中国兽医药品监察所，北京 100081;2.青岛农业大学，山东青岛 266000)

黄芪多糖注射液具有提高机体免疫力的功效，在兽医临床上作为辅助治疗应用广泛。但一些不法企业利用中药成分复杂、质量标准相对落后等缺点，在该注射液中非法添加化学类药物，以在短时间内起到明显的疗效，对用药安全带来巨大风险。本文采用旨在建立快速、简便的方法以检测出其中添加的四种解热镇痛类药物:安乃近、安替比林、对乙酰氨基酚和氨基比林。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪Waters 2695，二极管阵列检测器2998(PDA)，美国waters公司;METTLER AE240精密天平，精度0.01 mg，梅特勒精密仪器厂。安乃近对照品:批号H0291105，中国兽医药品监察所;安替比林对照品:批号H0020907，中国兽医药品监察所;对乙酰氨基酚对照品:批号100018－200408，中国药品生物制品检定所;氨基比林(高纯试剂):中国兽医药品监察所。供试品:25批不同厂家黄芪多糖注射液，市场购买;黄芪多糖提取物(含量以葡萄糖计25%):中国兽医药品监察所。甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件［1－2］与系统适用性 色谱柱采用迪马钻石 C18 柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);以磷酸盐缓冲液磷酸二氢钠6.0 g，加水1000 mL使溶解，加三乙胺1mL，用氢氧化钠试液调pH值至7.0)－甲醇(70 ∶30，V/V)为流动相;进样量 10 μL，流速1.0 mL/min。采用二极管阵列检测器，采集波长范围为190～400 nm，分辨率为1.2 nm，记录229 nm波长处的色谱图。

2.2 分离度测定 分离度测定溶液:取安乃近对照品60 mg，安替比林、氨基比林、对乙酰氨基酚对照品各25 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL于25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。(参照分离度测定溶液，分别制备对照品溶液，浓度分别为安乃近0.48 mg/mL，氨基比林、安替比林和对乙酰氨基酚0.24 mg/mL)。

供试品溶液:精密量取供试品1 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。

阴性对照溶液(无添加黄芪多糖溶液):取黄芪多糖提取物4 g(25%)，加水100 mL制成每1 mL中含0.1g(以葡萄糖计)的溶液。

取上述分离度测定溶液及阴性对照溶液各10 μL，按2.1项下色谱条件测定，结果见图1。四种待测成分完全分离，且阴性对照对测定结果无影响。

图1 分离度测定结果色谱图

2.3 精密度试验 取混合对照品溶液，连续进样5次，记录各色谱图峰面积。结果各主峰峰面积RSD均小于0.8%，表明精密度较好。

2.4 稳定性试验 取混合对照品溶液，于室温放置0、2、4、6、8、10、12 h 进样，结果各主峰峰面积RSD均小于1.2%，表明稳定性较好。

2.5 加样回收率试验 取安乃近对照品30、24、36 mg各三份，精密称定，置25 mL量瓶中，分别加阴性对照溶液各0.1 mL，按混合对照品溶液制备中稀释步骤稀释。

分别取安替比林、对乙酰氨基酚、氨基比林对照品10、12.5、15 mg 各三份，精密称定，置 25 mL量瓶中，加阴性对照溶液0.2 mL，照混合对照品溶液制备稀释步骤稀释。

按2.1项下色谱条件进样，并计算回收率和RSD。结果显示，安乃近、安替比林、氨基比林和对乙酰氨基酚的平均回收率分别为99.2%、99.9%、99.4%和100.3%;RSD 分别为 0.4%、0.5%、0.3%和0.7%。

2.6 线性与范围 取安乃近对照品约60 mg，安替比林、氨基比林、对乙酰氨基酚各25 mg，一同置于50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1、3、5、7、9 mL 于 25 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。按2.1项下色谱条件分别测定安乃近、安替比林、氨基比林、对乙酰氨基酚峰面积，以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标进行线性回归，结果见表2。

2.7 检测限 黄芪多糖储备液(安乃近检测限用):取阴性对照溶液0.1 mL置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。

黄芪多糖储备液(安替比林、氨基比林、对乙酰氨基酚检测限用):取阴性对照溶液0.2mL置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。

检测限溶液制备:分别取安乃近、安替比林、氨基比林、对乙酰氨基酚对照品溶液加甲醇进一步稀释至适宜浓度，加对应黄芪多糖储备液5 mL于25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，依法测定。光谱图失真前的浓度为该测试药物的检测限，光谱图未失真且S/N≥10为定量限。

2.8 耐用性试验 取混合对照品溶液，分别采用迪马 C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)、AT LiCHROM C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)、Alltima C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)三种色谱柱，改变流动相比例，水相—有机相分别为70∶30、65∶35和75∶25，按上述方法操作，结果四种成分仍能很好地分离且保留时间合理。在最佳实验条件的选择中流速的变化影响也不大，本方法的耐用性较好。

2.9 样品测定及结果判断 供试品溶液制备:取供试品1 mL，加甲醇100.0 mL，摇匀即得。按2.2项方法制备各对照品溶液。分别精密量取供试品溶液与各对照品溶液10 μL，按2.1项下色谱条件对25批供试品进行测定。供试品色谱图中如出现色谱峰与相应对照品峰保留时间一致(差异小于等于±5%);在大于190 nm的波长范围内，供试品出现的色谱峰与相应对照品色谱峰相对峰高大于10%时，两者光谱图无明显差异(必要时可调整供试品溶液的浓度);最大吸收波长一致(差异小于等于±2 nm)，判为检出被测试药物。

结果显示25批样品中7批检出安乃近，1批检出对乙酰氨基酚，结果见表3。色谱图及光谱图见图2。

表3 样品测定结果 mg/mL

其中100109除检出对乙酰氨基酚，100201、20100201、20100901除检出安乃近外，另有峰的保留时间、光谱指数图(见图2)非本文所列的目标化合物，其成分有待进一步分析。

图2 对照品、阳性样品光谱指数图及色谱图

3 讨论

3.1 HPLC－PDA检测方法利用待测物与其对应的对照品有相同的最大吸收波长，两者之间的偏差应在±2 nm之内，另根据保留时间的一致性可确定检出药物与其对应对照品为同一物质，而进行定性与定量测定。

3.2 本试验分别采用水、甲醇、甲醇－水(30∶70)为溶媒，进行了四种药物的溶解比较，结果发现溶媒中含水时，安乃近易降解，见图2中安乃近对照品色谱图(3)，与文献报道结果一致，主要降解产物为4－甲氨基安替比林［3］(MAA)。因而最终确定以甲醇为溶媒。在样品测定时，样品为水溶液，均可检测到MAA，因此测定结果中安乃近的含量并不能完全反应其实际添加量。

3.3 取相应对照品加甲醇稀释制成一定浓度的溶液，在本色谱条件下进样，确定该化合物的峰位并提取其光谱图指数图，以上四种解热镇痛类药物在229 nm左右均有吸收，且考虑安乃近在其他波长处吸收较弱并参考有关文献［2］，选择229 nm作为检测波长。

3.4 四种药物药效浓度不同，在黄芪多糖注射液中的添加量也不同，本研究在做回收试验时，以各药物在注射液中的规格为100%添加。样品测定时，供试品溶液浓度可能与对照品浓度不匹配，因掺假过程复杂，有的非只加一种成分，因此可根据测定结果调整供试品取样量，使检出成分色谱峰峰面积尽可能与对照品峰面积接近。

4 结论

在该色谱系统中黄芪多糖无紫外吸收对检出无干扰，因此可通过样品峰与对照品峰的保留时间、峰纯度以及光谱特征三方面的对比来确定黄芪多糖注射液中是否非法添加有该4种药物，方法简单、重复性好。本文检测了25批市售黄芪多糖注射液，发现1批添加对乙酰氨基酚;7批检出安乃近。由于化学药品添加量一般较大，因此掺伪的色谱峰容易识别。使用本文的方法，可以使黄芪多糖注射液中的非法添加检出更简单、系统。

［1］刘红云，郑 举，张 莉，等.HPLC法同时测定安痛定注射液中氨基比林和安替比林的含量［J］.中国兽药杂志，2009，43(9):5－7

［2］中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一〇年版二部［S］.

［3］沈金灿，庞国芳，谢丽琪，等.牛和猪肌肉组织中安乃近代谢物残留的液相色谱－串联质谱分析［J］.化学分析，2007，35(11):1565－1569.