不同抗原含量鸡减蛋综合征灭活疫苗的HI效价测定

邵攀峰，余彬辉，何叶峰，李少丽，王斌卿，胡志航，朱国坡

(杭州荐量兽用生物制品有限公司，杭州 310018)

鸡减蛋综合征是由鸡减蛋综合征病毒(EDSV－76)引起的以产生薄壳或无壳蛋，产蛋率严重下降为主要特征的传染病。自1976年荷兰科学家Van Eck等首次报道以来，许多国家及地区都报道了此病的流行，此病已成为当今世界范围内引起产蛋损失的主要原因之一［1］。目前，国内外均采用油乳剂灭活疫苗预防本病。为了减少因免疫次数多对鸡群的应激反应，近年来国内对联苗的研究也更加重视［2］。

本实验通过对鸡减蛋综合征病毒液高倍浓缩，然后根据不同稀释浓度抗原含量制备灭活疫苗，研究其抗体效价水平，为鸡减蛋综合征灭活疫苗，特别是鸡新城疫－减蛋综合征二联灭活疫苗、鸡新城疫－传染性支气管炎－减蛋综合征三联灭活疫苗、鸡新城疫－传染性支气管炎－减蛋综合征－禽流感四联灭活疫苗等与鸡减蛋综合征相关的多联灭活疫苗的研发及生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒种及抗原 EDSV HE02株生产毒种由杭州荐量兽用生物制品有限公司保存，EDS HI抗原及阳性血清购自中国兽医药品监察所。

1.1.2 种蛋及试验鸡 发育良好的10日龄普通鸭胚作为制苗材料，种蛋EDS HI抗体不高于1∶4;SPF鸡由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司购进SPF种蛋，孵化后置实验动物房隔离器内饲养。

1.1.3 主要仪器与试剂 Pellicon切向流超滤系统、膜Bioma×100面积为0.5 m2的标准膜堆均购自密理博中国有限公司。酪胨琼脂(G.A)、硫乙醇酸盐培养基(T.G)、葡萄糖蛋白胨汤(G.P)购自北京中海动物保健科技公司。

1.2 方法

1.2.1 鸡减蛋综合征病毒液的制备 选择发育良好的10日龄易感鸭胚，取生产用种毒100倍稀释，经尿囊腔接种，0.1 mL/胚。接种后密封针孔，置37.8℃下继续孵育，不必翻蛋。鸭胚接种后，每日照蛋一次，将72 h前死亡的鸭胚弃去。此后，每4～6 h照蛋1次，死亡的胚随时取出，直至120 h，不论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却24 h。将冷却的鸭胚取出，无菌吸取尿囊液，若干个鸭胚分为一组，吸取尿囊液放于同一灭菌的容器内，每组抽样测定血凝价，低于1∶10240(微量法)者弃去，将血凝价合格的尿囊液进行无菌检验。

1.2.2 病毒液的浓缩 先将病毒液用灭菌的100目/cm2的不锈钢漏斗滤过，再用离心机3000～5000 r/min离心10 min，进行预过滤。然后将预过滤的盛有病毒液的容器通过无菌管道与超滤装置连接，并反复循环通过超滤装置，直至达到要求的浓缩终点。

1.2.3 病毒含量测定 将病毒液用灭菌生理盐水10 倍系列稀释，取 10－6、10－7、10－83 个稀释度，接种已长成单层鸭胚成纤维细胞的96孔细胞培养板，每孔接种0.1 mL，每个稀释度接种6孔，观察120 h，记录各孔的细胞病变情况，计算细胞半数感染量(TCID50)。

1.2.4 红细胞凝集价 参照《中华人民共和国兽药典》附录中红细胞凝集试验(微量法)［3］进行测定。

1.2.5 灭活 浓缩后测定病毒含量合格的病毒液，按体积加入10%的甲醛溶液，至终浓度为0.1%(V/V)，充分振荡均匀，37℃恒温灭活16 h。灭活后逐瓶抽样，进行灭活检验。

1.2.6 无菌检验 参照《中华人民共和国兽药典》附录中无菌检验方法［3］。

1.2.7 灭活检验 取10日龄易感鸭胚5枚，尿囊腔接种灭活后的鸭胚尿囊液，0.1 mL/枚，每日照蛋2次，连续观察5 d。对所有胚液分别测定血凝价，无论是否出现血凝，均应盲传1代，测定血凝性，均为阴性时，判定灭活完全。

1.2.8 疫苗制备 将灭活后的EDSV抗原液用灭菌生理盐水进行 1 ∶8、1 ∶16、1 ∶32、1 ∶64、1 ∶128、1∶256稀释。参照《中华人民共和国兽用生物制品规程》中鸡减蛋综合征灭活疫苗制备方法［4］，制备不同抗原含量的灭活疫苗。

1.2.9 疫苗的性状检验、无菌检验、安全检验及甲醛、汞类防腐剂残留量测定 参照《中华人民共和国兽用生物制品规程》附录［4］对各批疫苗进行性状检验、无菌检验、安全检验及甲醛、汞类防腐剂残留量测定。

1.2.10 动物分组免疫 将70只21日龄SPF雏鸡随机分为7组，10只/组。按照抗原含量1∶8、1 ∶16、1 ∶32、1 ∶64、1 ∶128、1 ∶256 的稀释倍数分免疫组和空白对照组。颈部皮下接种，0.5 mL/只。

1.2.11 HI抗体效价测定 免疫后21 d，每只鸡分别翅静脉采血，分离血清。参照《中华人民共和国兽药典》附录中血凝抑制试验方法［3］，进行HI抗体效价测定。

2 结果与分析

2.1 制苗用病毒液的生产情况及浓缩前后的检验EDS病毒液经过Pellicon切向流超滤系统浓缩至6.5倍，浓缩前后的检验结果见表1。

表1 制苗用病毒液制备及浓缩前后检验情况汇总

2.2 制苗用病毒液的无菌检验及灭活检验结果EDSV灭活病毒液接种易感鸭胚盲传1代，测定HA效价，所有样品均呈HA阴性且胚胎发育正常，灭活检验合格，结果见表2。

表2 制苗用病毒液无菌及灭活检验结果

2.3 疫苗的性状检验、无菌检验、安全检验及甲醛、汞类防腐剂残留量测定 对各批疫苗进行了性状检验、无菌检验、安全检验及甲醛、汞类防腐剂残留量测定，结果完全能够达到规程中的各项要求，结果见表3。

表3 成品检验结果

2.4 HI抗体效价测定 接种后21 d，每只鸡分别采血，分离血清，进行HI抗体效价测定，结果见表4。

表4 免疫后各试验组鸡血清中HI抗体效价水平 log2

3 讨论

EDSV具有较好的免疫原性，由其制备的鸡减蛋综合征灭活疫苗对抵抗强毒攻击具有较高的保护率［5］。提高单位体积的抗原含量是联苗生产的技术关键，而抗原浓缩是达到此目的的理想办法［6－9］。多次鸡减蛋综合征病毒液浓缩试验结果证明，本试验选用的美国密理博公司的超滤浓缩装置系统，对鸡减蛋综合征病毒液浓缩效果较好，使用方便。浓缩过程滤出废弃液中无抗原成分滤出，没有抗原成分损失。HA效价和病毒含量与浓缩倍数在一定程度上呈正相关［10］，通过对浓缩后病毒液HA效价和TCID50的控制，可以保证使用浓缩后的胚液配苗。

本试验利用血凝抑制试验方法，测定免疫鸡第21天抗体效价水平，评价免疫后血清中的抗体水平。结果表明:随着抗原含量的降低，HI抗体效价水平也下降，浓缩6.5倍的灭活抗原再稀释256倍制备的鸡减蛋综合征灭活疫苗，虽然免疫鸡抗体效价的几何平均值达到质量标准要求，但是已有3/10不符合标准，且有4只免疫鸡仅仅符合标准，因此在实际生产中不建议使用此浓度稀释抗原配苗。研究表明:制备与鸡减蛋综合征相关的多联灭活疫苗，鸡减蛋综合征病毒液可根据HA效价和病毒含量适当调整浓缩倍数，以便确保疫苗质量和节约生产成本。

［1］BW卡尔尼克.禽病学［M］.第9版.高 福，刘文军，主译.北京:北京农业大学出版社，1991.

［2］蔡宝祥.近年来我国新城疫免疫研究进展［J］.中国家禽，2008，30(20):4 －7.

［3］中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二O一O年版［S］.

［4］中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程［M］.北京:中国农业科技出版社，2000.

［5］张再清，刘君侠，马维卿，等.鸡减蛋综合征油乳剂灭活疫苗效力试验和免疫抗体消长规律测定［J］.中国畜禽传染病，1997，19(6):40 －41.

［6］高以恒，叶凌碧.膜分离技术基础［M］.北京:科学出版社，1989:254－259.

［7］郑世兰，姜北宇，刘福致，等.用平板式超滤机浓缩鸡新城疫及法氏囊病毒试验效果观察［J］.华北农学报，1999，14(2):139－144.

［8］王明俊.兽医生物制品学［M］.北京:中国农业出版社，1997:149－153.

［9］姜北宇，刘月焕，景小冬，等.禽用疫苗病毒浓缩技术的研究［J］.华北农学报，2007，22(5):165 －171.

［10］阮武营，崔保安，李新生，等.新城疫病毒—减蛋综合征病毒抗原液与抗原浓缩液的HA效价关系［J］.中国畜牧兽医，2010，37(1):180 －181.