HPLC法测定帕那珠利含量

王翔林，王冠楠，钱 琛，陈 晨，康玉柱

(1.沈阳药科大学药学院，沈阳 110016;2.辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心，沈阳 110016;3.沈阳顺旺动物药业有限公司，沈阳 110300)

帕那珠利(Ponazuril)是德国Bayer公司开发的一种三嗪酮类抗原虫和球虫引起疾病的药物，化学名为(1－甲基－3－［3－甲基－4－(4－三氟甲基砜基 －l－苯氧基)－苯基］－［1，3，5］－三嗪 －2，4，6－三酮，结构式见图1。2001年经FDA批准在美国上市后迅速占领美国市场，成为美国兽医常用的抗原虫药物之一。目前，帕那珠利在中国尚未上市，但其强大的抗原虫效果和相对低廉的价格，决定了其在不远的将来会被广泛使用。

帕那珠利的含量测定方法主要有两类:HPLC法和LC－MS法，本文研究的是HPLC法。该方法相比较而言有速度快、成本低、简便易行的特点，且原料药含量较高，没必要使用液质连用检测。

帕那珠利虽然早在2001年就在FDA批准上市，但至今英国药典(BP)和美国药典(USP)上均不能找到该药物的原料药检测方法。帕那珠利的最大吸收峰为250 nm(图2)，本实验的测定方法是在参考文献的基础上，经过多次实验确定的。经测试，该色谱条件可以进行方法学验证。

1 仪器与材料

高效液相色谱仪:WATERS公司2695型高效液相色谱分析仪;WATERS公司2487型紫外检测器;Diamonsil C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm，美国迪马公司);工作站:WINDOWS系统下的Empower软件;KQ5200B超声波清洗器(江苏昆山超声波仪器厂)。AG285型电子天平(METTLER TOLEDO公司，精度为十万分之一);紫外分光光度计(SHIMADZU公司UV－1601型)。

帕那珠利对照品:批号 H20110508，纯度99.5%，沈阳顺旺动物药业有限公司提供;帕那珠利样品:批号20110618，沈阳顺旺动物药业有限公司提供;乙腈为色谱纯，Tedia公司;乙酸为优级纯，北京化工厂;水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Diamonsil C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:0.2%乙酸水溶液－乙腈(43∶57);流速1 mL/min;检测波长255 nm;柱温35℃。

2.2 样品和对照品储备液的制备 精密称定帕那珠利样品0.02554 g和对照品0.02668 g，分别置于100 mL容量瓶中，加入少量流动相，超声溶解后用流动相稀释至刻度，分别作为样品储备液和对照品储备液。

2.3 系统适应性实验 精密量取对照品储备液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入流动相稀释到刻度，摇匀。过 0.45 μm 滤膜后进样 10 μL，结果见图3。主峰帕那珠利理论塔板数为17236，分离度为 12.97，拖尾因子为 0.99。

图3 系统适用性图谱

2.4 方法学研究

2.4.1 线性 分别精密量取对照品储备液0.4、1、2、3、4 mL，置于 10 mL 容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，过 0.45 μm 滤膜，分别进样 10 μL，记录色谱图。以峰面积(y)对进样浓度(x)绘制标准曲线见图4，得到回归方程 y=25623x+2253.7，R2=0.9999。

图4 标准曲线

2.4.2 精密度

2.4.2.1 仪器精密度 精密量取对照品储备液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入流动相稀释至刻度，摇匀。过 0.45 μm 滤膜后进样 10 μL，重复进样 5 次，色谱峰面积为 645250、648470、648432、649585、647820，RSD 为 0.25% 。

2.4.2.2 方法重复性 精密称定帕那珠利样品和对照品，分别置于100 mL容量瓶中，加入少量流动相，超声溶解后用流动相稀释至刻度。然后精密量取样品和对照品溶液各1 mL，分别加入到10 mL容量瓶中。用流动相稀释至刻度。摇匀后过0.45 μm滤膜，进样10 μL(每个样进样两次)，计算样品的百分含量。结果见表1，平均含量为99.2%，RSD为0.69%(n=5)。

表1 方法重复性试验数据

2.4.3 回收率 精密量取9份样品储备液各2.5 mL，分别置于9个25 mL容量瓶中，然后精密量取对照品储备液2.0、2.5、3.0 mL 各 3 份，分别加入上述9个容量瓶中作为低、中、高浓度组。将9个容量瓶分别用流动相稀释至刻度，摇匀后过0.45 μm滤膜，进样10 μL(每个样品进样两次)，平均后的峰面积见表2，平均回收率为98.6%，RSD为1.2%(n=9)。

2.4.4 稳定性 精密量取帕那珠利样品0.02613 g和对照品0.02486 g，分别置于100 mL容量瓶中，加入少量流动相，超声溶解后用流动相稀释至刻度。精密量取样品和对照品溶液各5 mL，分别加入两个50 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度。摇匀后过0.45 μm 滤膜，在0、3、6、9、12、15、18、21、24 h进样10 μL(每个样品进样两次平均)，计算样品的百分含量，结果见表3，含量平均为97.2%，RSD为 0.74%。

3 讨论与结论

3.1 本实验参考了文献报道的多种流动相条件，并通过大量实验考察了磷酸盐缓冲液－乙腈系统、0.5%乙酸铵水溶液－乙腈系统、水－乙腈系统、0.05 mol/L甲酸水溶液 －乙腈系统、0.1%乙酸水溶液－甲醇系统、水－甲醇系统和0.2%乙酸水溶液－乙腈系统等流动相条件，最终确定以0.2%乙酸水溶液－乙腈(43∶57)为流动相较好。

表2 回收率试验数据

表3 稳定性试验数据

3.2 帕那珠利的实测最大吸收波长为250 nm，文献记载的检测波长为255 nm。分别用250 nm和255 nm进行了实验，其吸收度和峰面积均符合实验要求，且帕那珠利的前体原料托曲珠利的最大吸收为255 nm，采用255 nm检测有利于帕那珠利和其杂质的检测，因而最终决定采用255 nm为检测波长。

3.3 本实验条件理论塔板数很高，被测组分与杂质的分离度较好，拖尾因子在0.95～1.05之间。说明实验的色谱条件非常适合进行含量测定。

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