p73基因表达模式对于HeLa细胞萘醌类化疗药物敏感性的影响

胡晓鹃 徐灵均

1. 南昌大学医学院生物化学与分子生物学教研室，江西 南昌330006；2.南昌大学第二附属医院消化科，江西 南昌 330006

p73基因表达模式对于HeLa细胞萘醌类化疗药物敏感性的影响

胡晓鹃1徐灵均2

1. 南昌大学医学院生物化学与分子生物学教研室，江西 南昌330006；2.南昌大学第二附属医院消化科，江西 南昌 330006

背景与目的：p73基因的表达，在肿瘤发生、发展以及治疗转归各方面均具有十分重要的意义。本研究旨在探讨HeLa细胞p73基因表达模式对于该细胞萘醌类化疗药物(2,3-dichloro-5,8-dihydroxy-1,4-naphthoquinone，DDN)敏感性的影响。方法：运用TAp73(transcriptional active p73)特异性反义寡核苷酸干预HeLa细胞内p73基因表达模式，以RT-PCR法验证干预效果，同时观察细胞对于DDN药物敏感性的变化；运用MTT和TUNEL法分别检测在DDN药物作用下细胞活力以及凋亡指数(apoptosis index，AI)的变化情况。结果：TAp73特异性反义寡核苷酸特异性阻遏细胞TAp73的表达、下调TAp73/DNp73(dominant negative p73)表达比，从而明显降低HeLa细胞对于DDN的敏感性，导致该药物抑制细胞增殖以及诱导凋亡效能均显著下降(P均＜0.01)。相关性分析表明TAp73/DNp73的表达比与细胞活力呈负相关(r=-0.410，P＜0.01)；而TAp73/DNp73表达比与AI呈正相关(r=0.635，P=0.019)。结论：细胞内TAp73/DNp73表达比的变化对于调节HeLa细胞增殖以及凋亡具有重要的意义，针对该表达比的人工干预可明显影响HeLa细胞对于DDN药物的敏感性。

TAp73/DNp73表达比； 增殖抑制； 凋亡

p73基因自1997年在cos细胞中被偶然发现以来，作为p73家族的重要成员，一直受到广泛关注［1］。p73的表达产物可因羧基或氨基端的选择性剪接而产生不同的亚型。羧基端的选择性剪接造成的9种剪切异构体(α、β、γ、δ、ε、ζ、η、η1、θ)均由位于第一外显子的启动子1启动转录［2］，由于具有与p73相类似的转录激活功能，被统称为TAp73(transcriptional active p73)；而之后相继被发现的氨基端截断异构体，如p 73Δex2、p73Δex2/3、ΔN-p73、ΔNp73等，往往由位于第三外显子的启动子2启动转录，由于转录激活区(TA区)缺失或不完整，统称为DNp73(dominant negative p73)［3-4］。目前认为该基因的表达是一种“two gene in one”的模式［5-6］。

Vilgelm等［7］的研究证实，在肿瘤发生以及肿瘤耐药的过程中，p73基因表达模式(TAp73/DNp73表达比)的变化比单纯某一亚型表达水平的改变更有意义。甲萘醌(Vitamin K3)的新型类似物萘醌类药物(2,3-dichloro-5,8-dihydroxy-1,4-naphthoquinone，DDN)，在体内以及体外实验中均表现出广谱的抗肿瘤作用。由于其具有较多柔比星、丝裂霉素C等其他醌型结构化疗药物更低的生物毒性作用［8］，因此被认为是最具潜力的生长抑制剂和凋亡诱导剂之一。目前对于DDN抗肿瘤作用的分子机制尚不清楚，Kang等［9］报道在DDN作用下细胞内p73β的表达水平有所提高，并且p21、Bax的表达也呈p73依赖性模式。本研究小组之前的实验结果表明：在DDN导致细胞增殖抑制并发生凋亡的过程中，TAp73/DNp73表达比显著上调［10］。本研究旨在进一步探讨针对HeLa细胞内p73表达模式的人为干预，对该细胞DDN药物敏感性是否存在影响。

1 材料和方法

1.1 材料

DDN为美国Aldrich-Sigma公司生产；TRIzoTMReagent(总RNA提取试剂)购自美国Invitrogen公司；DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)购自美国Gibco公司；小牛血清购自杭州四季青公司；逆转录酶M-MLV、Rnasin、dNTP及TUNEL试剂盒(DeadEndTMColorimetric TUNEL System)均购自美国Promega公司；DNA 聚合酶LA Taq购自大连宝生物工程公司；MTT购自上海普飞生物技术公司；寡核苷酸链由上海捷倍思基因技术有限公司合成；脂质体LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司。

1.2 寡核苷酸的设计与合成

由GenBank中获取目的基因全序列，自行设计(表1)，经GenBank同源检测，未见与人类其他基因序列有同源性。寡核苷酸链均经硫代磷酸化修饰，PAGE纯化，冻干分装，-20 ℃保存。按脂质体LipofectamineTM2000说明书操作，以DMEM培养基分别稀释脂质体以及各寡核苷酸链，使用前将各备用液充分混合。

表 1 寡核苷酸链碱基序列Tab. 1 Sequences of oligonucleotides

1.3 细胞处理与分组

将常规培养的HeLa细胞分为4组：空白对照组、DDN药物单独处理组(依据本研究小组之前的研究结果［10］，选取15 μmol/L DDN为作用浓度)、反义组(15 μmol/L DDN+3条对应于不同位置的反义寡核苷酸、错义组(15 μmol/L DDN+错义寡核苷酸)，处理24 h后备用。

1.4 RT-PCR法测定细胞内TAp73/DNp73表达比

细胞总RNA提取，采用TRIzol试剂按其说明操作，所提取的总RNA溶解后用紫外分光光度仪测D260/280值，计算RNA纯度和浓度，通过甲醛变性凝胶电泳观察28S、18S带以检查RNA有无降解；cDNA合成，采用M-MLV逆转录酶，按其说明书操作；PCR扩增，由GenBank获取目的基因全序列，利用Primer Premier 5.0软件自行设计引物，其序列分别为：TAp73正义引物5’-CACCACGTTTGAGCACCTCT-3’，反义引物5’-GGCGATCTGGCAGTAGAGTTT-3’，全长共4 3 3 b p；D N p 7 3正义引物5’-CGAAAATGCCAACAAACGG-3’，反义引物5’-GGAGCAGACTGTCCTTCGTTG-3’，全长共6 7 6 b p；β-a c t i n正义引物5’-CTTCCTGGGCATGGAGTC-3’，反义引物5’-GCCGATCCACACGGAGTA-3’，全长共232 bp。反应以多重PCR方式，运用LA Taq酶，同时扩增内对照β-actin以及目的基因TAp73或DNp73。循环参数为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共22循环；72 ℃终延伸5 min。 取20 μL PCR扩增产物经1.5%琼脂糖(含溴化乙锭5 μg/mL)电泳，通过FR200图像分析软件(上海复日公司)读取目的电泳条带的斑点密度扫描值，以各组β-actin条带的扫描值标化其相应组的TAp73或DNp73基因的表达量，再以各组TAp73与DNp73基因表达的相对比值作为各组间相互比较的参数。

1.5 MTT法检测细胞增殖抑制率

以每孔1×104个HeLa细胞接种于96孔培养板，分组处理24 h后，加入新配制的MTT液每孔20 μL，置37 ℃，CO2体积分数为5%的培养箱内温育4 h；吸去上清液，加入二甲基亚砜150 μL，在振荡器上轻轻振荡10 min；用酶标仪于490 nm处测量吸光度(D)。细胞相对活力的计算，根据公式：细胞相对活力=(D实验组-D调零孔)/(D空白对照组-D调零孔)×100%。

1.6 TUNEL法测定细胞凋亡指数

运用DeadEndTMColorimetric TUNEL System，按其说明操作。DAB显色后，以苏木素进行细胞核复染，高倍镜(400×)下随机选择5～10视野，每个视野计100～200个细胞计算凋亡指数(apoptosis index，AI)。AI=凋亡阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.7 统计学处理

统计采用SPSS 18.0软件，针对各组参数进行组间方差分析；同时考量指标间(即TAp73/DNp73表达比与细胞相对活力、TAp73/DNp73表达比与细胞AI的)相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

为了明确细胞内p73基因表达模式变化对于细胞DDN药物敏感性是否存在影响，本研究在以DDN药物处理的同时，运用3条针对不同部位的TAp73特异性反义寡核苷酸进行p73基因表达模式的人为干预，并以错义寡核苷酸干预组和DDN药物单独处理组为对照。RTPCR法验证此法可特异性阻遏TAp73表达、下调TAp73/DNp73表达比，各组TAp73/DNp73表达比分别为0.018 7±0.036 6(反义组)、8.837 5±0.901 2(错义组)、9.411 4±1.174 2(DDN单独处理组)，组间方差分析显示，反义组与错义组及DDN单独处理组之间差异均有显著统计学意义(P<0.01)，而错义组与DDN单独处理组之间差异无统计学意义(P>0.05，图1)。

TAp73特异性反义寡核苷酸对于DDN抑制细胞增殖以及凋亡诱导的效应均有一定程度阻遏效应，降低细胞对于药物的敏感性。细胞相对活力反义组为(38.10±8.01)%、错义组为(12.10±3.82)%、DDN单独处理组为(18.00±4.80)% (图2)；TUNEL检测AI反义组为(29.00±3.02)%、错义组为(71.50±3.55)%、DNN单独处理组为(72.75±3.6 9)%、空白处理组为(2.86±0.30)%(图3)。组间方差分析显示反义组与错义组及DDN单独处理组之间细胞相对活力以及AI差异均有显著的统计学意义(P<0.01)，而错义组与DDN单独处理组之间差异无统计学意义(P>0.05)。

为考量TAp73/DNp73表达比变化与HeLa细胞对于DDN药物细胞增殖抑制以及凋亡诱导两方面生物效应的敏感性是否存在相关性，本研究进行了各指标间的相关性分析：TAp73/DNp73表达比与细胞增殖力之间呈负相关(r=-0.410，P<0.01)；而与AI呈正相关(r=0.635，P<0.01)。

综合以上实验结果显示，HeLa细胞内p73基因表达模式对于其细胞活力以及凋亡过程有着十分重要的意义；针对p73基因表达模式的人为干预可明显改变细胞DDN化疗药物的敏感性。

3 讨 论

本研究小组之前的实验结果表明，DDN具有较好的抑制HeLa细胞增殖、诱导其凋亡的抗肿瘤活性，并且在此过程中细胞内TAp73 mRNA水平增高，TAp73/DNp73表达比明显上调［10］。有研究发现，在针对恶性肿瘤的化学治疗过程中，p73基因表达模式往往发生明显变化：喜树碱、VP16、顺铂、多柔比星以及紫杉醇等一线肿瘤化疗药物往往都能引起细胞内TAp73的水平增高［11］，这些都与本研究结果相吻合。为了进一步探讨TAp73/DNp73表达比变化与细胞增殖及凋亡转归之间的相关性，本研究以反义寡核苷酸特异性抑制TAp73表达，观察HeLa细胞对于DDN药物敏感性的变化。

以TAp73特异性反义寡核苷酸作用后，HeLa细胞内TAp73 mRNA水平被特异性降低，TAp73/DNp73表达比倒置。由此说明采用反义寡核苷酸技术可以有效地特异性阻遏p73某一类亚型的表达，是一种较为简便且成本较低的人为改变细胞内p73基因表达模式的策略。

通过与DDN药物单独处理组以及错义寡核苷酸对照组相对比，反义寡核苷酸特异性抑制TAp73表达后，HeLa对于DDN药物的敏感性明显下降。该药物抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用均显著受到干扰。相关性分析表明TAp73/DNp73表达比的改变与细胞增殖以及凋亡的转归有一定关联。另外，一些临床证据表明，DNp73的局部表达可引发化疗药物耐药［12-14］，由此征示着TAp73与DNp73作为同一个基因的两类产物，彼此之间有着非常密切的关联性，相互影响共同调节细胞的增殖与凋亡过程。

许多抑癌蛋白在细胞增殖与凋亡的过程中起着重要的调节作用，如p53和TAp73，为避免细胞过度凋亡，机体对于TAp73和p53的功能也有着严密的调节机制。有研究表明，在DNp73中的ΔNp73启动子区域发现p53相关元件，它含有3个半结合位点，位于帽子结构-78至-47［4］。与此相类似，TAp73也可通过结合位于ΔNp73启动子序列-76到-57的TAp73特异性元件，激活内源性ΔNp73的转录［15］。由此，p53和TAp73可结合ΔNp73启动子序列以诱导其表达；而DNp73又反过来通过竞争性抑制以及形成寡聚体的方式，阻遏p53和TAp73针对各下游基因(包括其自身)的转录激活作用［4,16］，以此形成一个负反馈环，确保对于p53和TAp73功能的准确调控。

值得注意的是，p53/TAp73的拮抗剂过度表达往往可导致恶性肿瘤的发生，如MDM2［17］。DNp73由于能使p53和TAp73的抑癌作用失活，而被认为可能也与肿瘤的发生有着一定的关联［18］。在乳腺癌以及外阴鳞癌等多种肿瘤组织中DNp73均呈过表达状态［19-20］；在大多数的肿瘤细胞株中，TAp73/DNp73的表达比值均与正常组织或胎儿组织不同［4］。动物实验发现，TAp73特异性缺失的小鼠可出现自发性肿瘤［21］，而p73基因敲除的小鼠未出现此现象［22］。由此表明对于细胞的恶变、增殖与凋亡，TAp73与DNp73两类异构体的表达相对量远比单一异构体的绝对量更为重要。

同时，我们也应看到即便将TAp73 mRNA水平降至极低的水平，DDN对于HeLa细胞的抑制作用依然存在，细胞相对活力为(18.0±4.8)%；AI为(29.0±3.0)%，与空白对照组相比仍有显著性差异。这表明细胞凋亡与增殖的调控是一个多途径共同参与的过程，而DDN药物抗肿瘤机制也可能同时涉及多个靶点。

p73基因表达模式的变化可显著改变细胞对于化疗药物DDN的敏感性，并影响细胞的转归。由此在临床诊疗过程中，针对化疗药物耐药的肿瘤病例，p73基因表达模式将有可能作为一个重要的作用靶点，增强肿瘤的药物敏感性，以此为多种化疗药物联合治疗提供新的思路。

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The impact ofp73gene expression pattern on HeLa cell’s sensitivity to a naphthoquinone analog

HU Xiao-juan,XU Ling-jun(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Medical College of Nanchang University, Nanchang Jiangxi 330006, China)

HU Xiao-juan E-mail：huxiaojuan@163.com

Background and purpose：The expression ofp73gene is of great importance in both carcinogenesis and chemotherapy sensitivity. The purpose of this study was to investigate the impact ofp73gene expression pattern on HeLa cell’s sensitivity to a naphthoquinone analog, termed 2,3-dichloro-5,8–dihydroxy-1,4-naphthoquinone(DDN).Methods：TAp73-specific antisense oligonucleotide was applied to interfere HeLa cellularp73gene expression pattern. The effect of antisense oligonucleotide was certified by RT-PCR. Meanwhile, the sensitivity of HeLa to DDN’s proliferation inhibition and apoptosis induction was monitored. Cell viability and apoptosis index were measured by MTT and TUNEL respectively, after TAp73-specific antisense oligonucleotide and DDN treatment.Results：The antitumor activity of DDN, both growth inhibition and apoptosis induction, could be obviously but partly blocked by the intervention of TAp73-specific antisense oligonucleotide. The cell viability and apoptosis index were closely related to the cellular expression ratio of TAp73/DNp73 (r=-0.410,P＜0.01;r=0.635,P=0.019, respectively).Conclusion：The expression ratio of TAp73/DNp73 is important for HeLa cell’s proliferation and apoptosis. Changes inp73gene expression pattern interferes the sensitivity of HeLa cell to DDN.

Expression ratio of TAp73/DNp73; Growth inhibition; Apoptosis

10.3969/j.issn.1007-3969.2012.02.006

R73-36+1

A

1007-3639(2012)02-0108-06

江西省教育厅科技计划项目(No：GJJ08092)；南昌大学科研基金(2008)。

胡晓鹃 E-mail:huxiaojuan@163.com

2011-09-19

2011-12-22）