子宫内膜癌中elF4E与VEGF的表达及其临床意义

曹世姣 张广亮 喻 芳 叶柳青 夏伟兰

南方医科大学附属南方医院妇产科，广东 广州 510515

子宫内膜癌中elF4E与VEGF的表达及其临床意义

曹世姣 张广亮 喻 芳 叶柳青 夏伟兰

南方医科大学附属南方医院妇产科，广东 广州 510515

背景与目的：真核细胞翻译起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E)是蛋白翻译过程中的调控因子，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是血管生成过程中的关键因子，eIF4E及VEGF的表达异常可能参与肿瘤的发生、发展。本研究旨在探讨eIF4E及VEGF与子宫内膜癌发生、发展的关系及其临床意义。方法：采用免疫组化SP法检测eIF4E与VEGF在27例子宫内膜腺癌(endometrial adenocarcinoma，EA)、16例Ⅱ型子宫内膜癌及20例正常子宫内膜中的表达情况，并分析两者与子宫内膜癌临床病理特征的关系以及两者表达的相关性。结果：eIF4E在Ⅰ型及Ⅱ型子宫内膜癌中表达的MVD值分别为0.18±0.05和0.20±0.07(P=0.224)，两组表达与正常组相比，差异均有统计学意义(P＜0.000)；VEGF在Ⅰ型及Ⅱ型子宫内膜癌表达的MVD值分别为0.16±0.06和0.18±0.07(P=0.387)，两组与正常组相比，差异均有统计学意义(P＜0.000)。eIF4E表达与子宫内膜腺癌FIGO分期、组织学分级及淋巴转移呈正相关(P＜0.05)，与年龄及浸润深度无关(P＞0.05)；VEGF表达与FIGO分期、组织学分级、淋巴转移及浸润深度呈正相关(P＜0.05)。eIF4E及VEGF在子宫内膜癌中的表达呈正相关(r=0.565，P=0.001)。结论：eIF4E及VEGF与子宫内膜癌的发生、发展及生物学行为关系密切，可初步考虑作为子宫内膜癌恶性改变的分子标志。

子宫内膜癌； 真核细胞翻译起始因子4E； 血管内皮生长因子

真核细胞翻译起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E)为一种新的肿瘤标志物，在蛋白质翻译的调节中起重要作用，其过度表达选择性地增加一些基因产物的表达，如原癌蛋白(c-myc、cyclin Dl)、血管形成因子(FGF)及肿瘤浸润相关基因产物等［1］。这些基因产物的高表达参与肿瘤的发生、发展，特别是血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的过度表达可使肿瘤新生血管生成增加，不仅为癌细胞活跃生长分化提供丰富的营养物质，还可促进癌细胞向远处浸润转移［2］。本研究采用SP免疫组化法检测了子宫内膜癌组织中eIF4E及VEGF的表达情况，为子宫内膜癌早期诊断、靶向治疗及预后评价提供理论基础。

1 资料和方法

1.1 临床资料

43例子宫内膜癌石蜡包埋标本取自2007年—2010年南方医科大学附属南方医院病理科，标本经手术切除病理学证实；年龄≥50岁27例，<50岁16例；绝经前28例，绝经后15例；FIGO手术病理分期Ⅰ期25例，Ⅱ期10例，Ⅲ期8例；低分化者5例，中分化者21例，高中分化者17例；子宫内膜样腺癌(EA，Ⅰ型)27例，子宫内膜癌(Ⅱ型)16例，其中腺鳞癌12例，乳头状浆液性腺癌2例，棘腺癌1例，透明细胞癌1例；肌层浸润<1/2肌层者31例，≥1/2肌层者12例；无淋巴转移者37例，有淋巴转移者6例。同期因子宫肌瘤行子宫全切后的子宫内膜标本20例作为对照组。所有患者月经规律，无合并症及并发症，无妇科内分泌疾病及放置宫内节育器等病史，术前半年均未使用激素类药物治疗史。两组临床资料对比差异无统计学意义。

1.2 主要试剂

兔抗人eIF4E多克隆抗体购自美国CST公司，兔抗人VEGF多克隆抗体、SP免疫组化试剂盒及DBA显色剂均购自博奥森生物科技公司。eIF4E抗体稀释浓度为1∶300，VEGF抗体稀释浓度为1∶250。

1.3 实验方法

采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶链接法(SP法)检测，具体步骤如下：⑴石蜡标本2 μm连续切片；⑵脱蜡至水；⑶柠檬酸盐高温修复抗原；⑷3%过氧化氢酶室温下阻断10 min，非免疫动物血清室温温育10 min；⑸滴加一抗后4 ℃过夜；⑹生物素标记的二抗室温温育10 min；⑺链霉素抗生物素-过氧化酶溶液室温温育10 min；⑻DAB显色10 min；⑼流水冲洗、苏木素复染、自来水返蓝；⑽梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。以PH为7.2~7.4磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为空白对照，以乳腺癌组织(已知阳性)作为阳性对照。

1.4 结果判读

所有切片以细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性反应。采用OLYMPUS-BX51正置荧光显微镜观察染色结果，每张切片先在低倍镜(10×10)下筛选出阳性表达较强的区域，然后在高倍镜(10×40)下随机选择5个不连续有代表性的视野进行拍照。OLYMPUS-DP2-BSW全自动图像分析系统对彩色图像进行采集与存储，使用美国Mediacybernetics公司的图像分析软件image pro-plus v6.0对所采集的图像进行阳性区域的光密度定标，测定每个视野的平均光密度值(mean optical density，MOD)，MOD=sum(IOD)/sum(area)。对MOD值进行统计学分析，MOD值越高，表达越强。

1.5 统计学处理

应用统计学软件SPSS l3.0建立数据库，数据分布的正态性检验采用Shapiro-wilk正态性分析；正态分布的数据，进一步检验样本总体方差是否齐性。方差齐者MOD值的比较采用One-Way ANOVA 方差分析；偏态分布及方差不齐数据，MOD值的比较采用样本的非参数检验。eIF4E和VEGF两者表达的相关性采用Pearson相关分析法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 eIF4E及VEGF在子宫内膜癌中的表达

eIF4E蛋白呈棕黄色弥漫定位于子宫内膜腺上皮细胞质中，少部分低分化的癌组织细胞核中亦可见棕黄色表达，间质未见表达(表1，图1)；VEGF蛋白主要定位于子宫内膜腺上皮细胞质及细胞膜，癌组织周围增生的血管内皮细胞质中亦可见阳性表达(图2)。eIF4E及VEGF在Ⅰ型及Ⅱ型子宫内膜癌中表达的微血管密度(micro vascular density，MVD)值均显著高于正常子宫内膜(P<0.000)，eIF4E及VEGF表达与子宫内膜癌分型无明显相关(P=0.224，P=0.387)。

表 1 eIF4E与VEGF在子宫内膜癌组织中表达MVDTab. 1 Expression of eIF4E and VEGF protein in endometrial carcinoma(±s)

表 1 eIF4E与VEGF在子宫内膜癌组织中表达MVDTab. 1 Expression of eIF4E and VEGF protein in endometrial carcinoma(±s)

Compared with normal groups, *: P=0.000; Compared with endometrial adenocarcinoma : #: P=0.224; △: P=0.387.

Group n eIF4E VEGF Normal endomedium 20 0.109±0.018 0.084±0.019 Endometrial adenocarcinoma 27 0.178±0.053* 0.162±0.061*Endometrial carcinoma (type Ⅱ)16 0.201±0.067*,#0.179±0.067*,△

2.2 eIF4E及VEGF与子宫内膜癌临床病理特征的相关性

eIF4E表达与子宫内膜癌年龄及浸润深度无关(表2，P>0.05)，与FIGO分期、组织学分级及淋巴转移相关，差异有统计学意义(P<0.05)，且随着分期越晚、分级越高，eIF4E阳性表达程度增高；VEGF表达与子宫内膜癌患者FIGO分期、组织学分级、淋巴转移及浸润深度显著相关(P<0.05)，与年龄无关(P>0.05)。因子宫内膜癌(Ⅱ型)例数较少，未能统计eIF4E及VEGF与子宫内膜癌(Ⅱ型)临床病理特征的相关性。

2.3 eIF4E和VEGF表达的相关性

Pearson积差相关分析显示：eIF4E与VEGF在子宫内膜癌中的表达呈正相关(r=0.667，P=0.001)，提示eIF4E与VEGF在子宫内膜癌的发生、发展中有相互促进作用。

表 2 eIF4E及VEGF表达与子宫内膜腺癌临床病理参数的关系 MVDTab. 2 Associations of eIF4E and VEGF expression with clinical pathological parameters in endometrial adenocarcinoma

3 讨 论

子宫内膜癌是常见的女性生殖道三大恶性肿瘤之一，WHO将其分为雌激素依赖性(Ⅰ型，主要为子宫内膜样腺癌)及非雌激素依赖性(Ⅱ型，包括腺鳞癌、浆液性乳头状癌等)。子宫内膜样腺癌占所有内膜癌的80%~90%，较Ⅱ型患者恶性程度低、侵袭转移慢、预后好。探讨eIF4E及VEGF与子宫内膜癌临床病理特征的关系，为子宫内膜癌早期诊断、靶向治疗及预后评价有至关重要的作用。

eIF4E可特异性地与真核细胞mRNA的5’端帽结构结合，形成翻译起始复合物，启动翻译过程。正常情况下eIF4E表达有限，多结合编码管家蛋白的“强”mRNA，这类mRNA的5’-UTRs少于200个核甘酸序列且缺少上游的AUG，很容易与eIF4F结合扫描并有效地翻译，维持细胞正常形态及功能；而含G+C丰富的长的5’-UTRs的mRNA以及具有复杂二级结构的“弱”mRNA则选择性不翻译，从而限制许多与恶性肿瘤相关蛋白质的表达；eIF4E表达受自身磷酸化、翻译抑制蛋白家族活性(如4EBP1)及其基因转录(如ras、c-myc基因)等因素的调节，各种因素导致eIF4E过度表达时并不能增加“强”mRNA的翻译，但可使“弱”mRNA表达增加，从而翻译大量与肿瘤生长分化及浸润转移相关的蛋白质，如原癌蛋白(c-myc、cyclin D1、ODC和Rb蛋白)、血管形成因子(FGF2、VEGF)、基质降解酶(MMP-2、9)以及缺氧诱导因子-1(HIF-1)等，从而促进肿瘤的发生、发展，本实验eIF4E与VEGF在子宫内膜腺癌中的表达呈显著正相关，证实了eIF4E可上调VEGF水平，两者表达有相互促进作用；“弱”mRNA表达增加，还可使细胞生长加速，产生形态上的改变以及使细胞经历畸形有丝分裂和(或)凋亡，使基因不稳定而导致细胞癌变［4-5］。

近年，大量体内外研究发现eIF4E过度表达参与恶性肿瘤的发生发展。Graff等［6］将T24ras转染鼠胚胎纤维母细胞(CREE)，发现eIF4E磷酸化加强，抑癌蛋白nm23、胶原酶Ⅳ及黏附分子CD44等蛋白翻译速度增加，而siRNA抑制eIF4E后肿瘤细胞增殖潜伏时间及体积倍增时间增加，细胞浸润及实验性转移受到抑制。在体外，多数研究证实eIF4E高表达与乳腺癌、结肠癌及头颈癌等恶性肿瘤的发生、发展及浸润转移相关，并可预测肿瘤的预后［7］；Choi等［8］发现eIF4E蛋白在子宫内膜腺癌中过度表达，Ⅲ～Ⅳ期明显高于Ⅰ～Ⅱ期，而正常内膜未发现过度表达，提示eIF4E蛋白过度表达与子宫内膜腺癌恶性程度相关。迄今eIF4E与子宫内膜癌的关系国内报道较少，本研究显示Ⅰ、Ⅱ型子宫内膜癌中eIF4E的表达均显著高于正常子宫内膜组，而Ⅰ型与Ⅱ型子宫内膜癌中eIF4E表达差异无统计学意义(P>0.05)，提示eIF4E过度表达可能导致子宫内膜癌的早期改变，但不足以成为鉴别两型子宫内膜癌的分子标志；本实验eIF4E表达与子宫内膜腺癌FIGO分期、组织学分级及淋巴转移显著相关，而与年龄及浸润深度无关，提示eIF4E高表达可能参与子宫内膜腺癌的发生、发展及浸润转移，其表达水平对评价子宫内膜腺癌的恶性程度有一定的价值，有望成为子宫内膜腺癌治疗的新靶点。

肿瘤的血管生成主要由肿瘤细胞产生的血管形成因子诱导，VEGF为血管生成中最关键的因子。VEGF与其特异性受体结合后刺激血管内皮细胞生长、诱导新生血管腔形成及增加血管通透性，为肿瘤生长提供大量营养物质以及为肿瘤细胞浸润及远处转移提供了机会。研究表明基因型为VEGF-A-/-的小鼠会表现为严重的血管生长缺陷，在胚胎期E为9.5～10.5时死亡［9］。文献报道正常子宫内膜VEGF增殖期低表达，分泌期表达增高；基底层表达高于功能层，间质表达低于腺体；正常内膜表达明显低于子宫内膜增生及子宫内膜癌，这提示VEGF参与子宫内膜生理性修复，但过度表达导致子宫内膜恶变［10-11］。Guşet等［12］发现子宫内膜癌患者MVD及VEGF表达G2/G3级明显高于G1级，Ⅲ～Ⅳ期明显高于Ⅰ～Ⅱ期，并指出MVD及VEGF表达水平可作为子宫内膜癌预后评价的指标。本实验结果提示VEGF在Ⅰ型及Ⅱ型EC中表达均明显高于正常组，VEGF亦高表达于癌巢周围新生的血管内皮细胞质中，提示肿瘤细胞可分泌大量VEGF并介导肿瘤自身新生血管生成；VEGF表达与子宫内膜腺癌FIGO分期、组织性分级、淋巴转移及浸润深度均明显相关，提示VEGF过度表达为子宫内膜腺癌的发展、浸润及远处转移提供了条件。

eIF4E作为恶性蛋白质翻译过程中关键因子，VEGF作为血管生成过程中的关键因子，两者过量表达可作为子宫内膜癌恶性改变的分子标志，为子宫内膜癌的靶向治疗提供了坚实的理论基础。目前，针对eIF4E及VEGF的靶向治疗近年报道较多，如通过siRNA抑制eIF4E的表达，可使三阴乳腺癌细胞增殖周期停滞及细胞菌落形成受到抑制，还可增加癌细胞对化疗药物的敏感性［13］；Darb-Esfahani等［14］证实通过m-TOR抑制剂雷帕霉素抑制eIF4E过度表达后，子宫内膜癌Ishikawa细胞生长增殖明显被抑制；Choi等［8］研究通过siRNA使eIF4E表达下调可有效抑制子宫内膜腺癌HEC-1A细胞系的生长；VEGF单克隆抗体贝伐单抗等药物在肾癌、结肠癌、小细胞肺癌等恶性肿瘤疗效显著［15-16］，可有效抑制恶性肿瘤进展，该药在子宫内膜癌的辅助治疗也已进入Ⅱ期临床试验［17］。可见，未来可从抑制eIF4E及VEGF基因靶向治疗、抑制血管生成等方面探讨子宫内膜癌有效的治疗方式。但由于肿瘤的发生、发展受到众多因素的影响，eIF4E及VEGF靶向治疗需配合手术、放疗、化疗及免疫治疗以提高子宫内膜癌的整体治疗水平。

［1］CULJKOVIC B, TOPISIROVIC I, SKRABANEK L, et al.eIF4E is a central node of an RNA regulon that governs cellular proliferation ［J］. J Cell Biol, 2006, 175(3): 415-426.

［2］DVORAK H F, BROWN L F, DETMAR M, et al. Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor,microvascular hyperpermeability, and angiogenesis ［J］. Am J Pathol, 1995, 146(5): 1029-1039.

［3］JONES R M, BRANDA J, JOHNSTON K A, et al. An essential E box in the promoter of the gene encoding the mRNA capbinding protein (eukaryotic initiation factor 4E) is a target for activation by c-myc ［J］. Mol Cell Biol, 1996, 16(9): 4754-4764.

［4］SONENBERG N, GINGRAS A C. mRNA 5 cap-binding protein eIF4E and control of cell growth ［J］. Curr Opin Cell Biol, 1988, 10(2): 268-275.

［5］GRAFF J R, ZIMMER S G. Translational control and metastatic progression: enhanced activity of the mRNA capbinding protein elF-4E selectively enhances translation of metastasis related mRNAs ［J］. Clin Exp Metastasis, 2003,20(3): 265-273.

［6］GRAFF J R, BOGHAERT E R, DE BENEDETTI A, et al.Reduction of translation initiation factor 4E decreases the malignancy of ras-transformed cloned rat embryo fibroblasts［J］. Int J Cancer, 1995, 60(2): 255-263.

［7］DE BENEDETTI A, GRAFF J R. eIF-4E expression and its role in malignancies and metastases ［R］. Oncogene, 2004,23(18): 3189-3199.

［8］CHOI C H, LEE J S, KIM S R, et al. Direct inhibition of eIF4E reduced cell growth in endometrial adenocarcinoma ［J］. J Cancer Res Clin Oncol, 137(3): 463-469.

［9］CARMELIET P, FERREIRA V, BREIER G, et al. Abnormal blood vessel development and lethality in embryos lacking a single VEGF allele ［J］. Nature, 1996, 380(6573): 435-439.

［10］NARD0 L G. Vascular endothelial growth factor expression in the endometrium during the menstrual cycle, implantation window and early pregnancy ［R］. Curr Opin Obstet Gynecol, 2005, 17(4): 419-423..

［11］DAI H, ZHAO S, XU L, et al. Expression of EFP, VEGF and bFGF in normal, hyper-plastic and malignant endometrial tissue ［J］. Oncol Rep, 2010, 23(3): 795-799.

［12］GUSET G, COSTI S, LAZAR E, et al. Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and assessment of microvascular density with CD34 as prognostic markers for endometrial carcinoma ［J］. Rom J Morphol Embryol, 2010,51(4): 677-682.

［13］ZHOU FF, YAN M, GUO GF, et al. Knockdown of eIF4E suppresses cell growth and migration, enhances chemosensitivity and correlates with increase in Bax/Bcl-2 ratio in triple-negative breast cancer cells ［J］. Med Oncol,2011, 28(4): 1302-1307.

［14］DARB-ESFAHANI S, FAGGAD A, Noske A, et al. PhosphomTOR and phospho-4EBP1 in endometrial adeno- carcinoma:association with stage and grade in vivo and link with response to rapamycin treatment in vitro ［J］. J Cancer Res Clin Oncol, 2009, 135(7): 933-941.

［15］COPPIN C, KOLLMANNSBERGER C, LE L, et al. Targeted therapy for advanced renal cell cancer (RCC): a Cochrane systematic review of published randomised trials［J］. J Nucl Med, 2011, 52(10): 1630-1637.

［16］KOUKOURAKIS G V, SOTIROPOULOU-LONTOU A.Targeted therapy with bevacizumab (Avastin) for metastatic colorectal cancer ［J］. Clin Transl Oncol, 2011, 13(10):710-714.

［17］AAHAJANIAN C, SILL M W, DARCY K M, et al. Phase II trial of bevacizumab in recurrent or persistent endometrial cancer: a Gynecologic Oncology Group study［J］. J Clin Oncol, 2011, 29(16): 2259-2265.

Expression of eIF4E, VEGF in endometrial carcinoma and their clinical signification

CAO Shijiao, ZHANG Guang-liang, YU Fang, YE Liu-qing, XIA Wei-lan(Department of Obstetrics and Gynecology, Nanfang Hospital, Nanfang Medical University, Guangzhou Guangdong 510515, China)

ZHANG Guang-liang E-mail：zgl851@yahoo.com.cn

Background and purpose：eIF4E is the regulation factor of protein translation process and VEGF is the key factor in angiogenesis. The abnormal expression of eIF4E and VEGF are correlated with the emergence and development of tumor. This study tested the expression of eIF4E and VEGF in endometrial carcinoma (EC) so as to investigate the clinical significance between them and EC.Methods：In 27 cases of endometrial adenocarcinoma (EA),16 cases of EC (type Ⅱ) and 20 cases of normal endomedium (NE), the expressions of eIF4E and VEGF were detected by immunohistochemical method of SP and the relationship with the pathological phenotype of EA were analyzed.Results：The mean optical density (MOD) of eIF4E in EA and EC (type Ⅱ) were 0.178±0.053 and 0.201±0.067(P=0.224), respectively, which were higher than that of NE (P＜0.000). The MVD of VEGF in EA and EC (typeⅡ) were 0.162±0.061 and 0.179±0.067 (P=0.387), respectively, which were higher than that of NE (P＜0.000). The expression of eIF4E was positively correlated with FIGO stage, differentiation degree and lymph node metastasis in EA,and there was also a positive relationship between the expressions of VEGF with the FIGO stage, differentiation degree,infiltration degree and lymph node metastasis. Positive correlation were observed between eIF4E and VEGF expression of EA (r=0.359,P=0.018).Conclusion：The expressions of eIF4E and VEGF were positively associated with emergence, development and clinicopathologic features of EC, indicating that their expression may be the prognostic factors for EC.

Endometrial carcinoma; Eukaryotic initiation factor 4E; Vascular endothelial growth factor

10.3969/j.issn.1007-3969.2012.02.008

R737.33

A

1007-3639(2012)02-0120-05

张广亮 E-mail:zgl851@yahoo.com.cn

2011-12-25

2012-02-05）