中国水蛇同工酶生化遗传特征的性别间比较

贾守菊，赵，沈思磊，张永普,†

(1．温州大学生命与环境科学学院，浙江温州 325035；2．中国农业大学生物学院，北京 100193)

中国水蛇同工酶生化遗传特征的性别间比较

贾守菊1，赵2，沈思磊1，张永普1,†

(1．温州大学生命与环境科学学院，浙江温州 325035；2．中国农业大学生物学院，北京 100193)

采用聚丙烯酰胺凝胶不连续垂直平板电泳技术对中国水蛇雌雄两性个体肌肉的苹果酸脱氢酶（MDH）、苹果酸酶（ME）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、酯酶（EST）、乳酸脱氢酶（LDH）、醇脱氢酶（ADH）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）和谷氨酸脱氢酶（GDH）等9种同工酶进行生化遗传分析，共记录了31个基因座位、58个等位基因，其中有16个基因座位（Mdh-1、Mdh-2、Mdh-3、Me-1、Me-2、G6pdh-3、Est-1、Est-2、Est-3、Est-4、Sod-1、Sod-2、Sod-3、Sod-4、Pod-1和Pod-2）为多态，多态座位比例（P）为51.6%．雌雄两性的ADH和LDH两种同工酶的酶带表达不存在差异；其他7种酶均存在不同程度的差异．雌性个体间有3种酶（ADH、LDH和SOD）、雄性个体间有6种酶（ME、ADH、GDH、LDH、SOD和POD）在表达上基本无差异．

中国水蛇；同工酶；生化遗传特征；性别

同工酶分析有助于研究细胞分化、物种形成过程中基因作用机理以及生物群体的遗传进化规律，在爬行动物种群遗传结构分析、进化、系统分类、个体发育等方面有着广泛的应用[1-2]．有关蛇类同工酶研究大多集中于其种间和种内不同组织同工酶酶谱的差异，种内不同个体间及雌雄性别间的比较未见报道．中国水蛇（Enhydris chinensis）分布于中国的江苏、浙江、江西、福建、台湾、广东、海南、广西、湖南、湖北以及越南北部[3]．本文采用聚丙烯酰胺凝胶不连续垂直平板电泳，对中国水蛇雌雄两性不同个体的苹果酸脱氢酶（MDH）、苹果酸酶（ME）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、酯酶（EST）、乳酸脱氢酶（LDH）、醇脱氢酶（ADH）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）、谷氨酸脱氢酶（GDH）等9种同工酶进行生化遗传分析，旨在探讨其种内性别间的变异能力．

1 材料和方法

1.1 样本采集和保存

中国水蛇于2009年7月和2011年7月采自浙江省平阳县桃源乡．将水蛇活体带回实验室，挑选健康的雌雄个体各10条．经性别鉴定和电子天平称重后，置于冰盘中，进行活体解剖，取出肌肉组织，逐条装袋称重，保存于-70℃冰箱备用．

1.2 样本制备

取不同个体的肌肉组织，按1∶2（质量∶体积）比例加入酶提取液[100 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH7.6），内含40 g蔗糖、0.106 6 g抗坏血酸和0.073 3 g L-半胱氨酸]，在冰浴下置匀浆器中研磨，匀浆于4℃冷冻离心机中以12 000 r/min转速离心30 min，取上清液分装，50 µL/管，置于-70℃冰箱保存备用．

1.3 电 泳

采用聚丙烯酰胺凝胶不连续垂直平板电泳[4]，凝胶浓度及缓冲系统见表1．仪器为北京六一仪器厂DYY-12C型稳压稳流电泳仪和DDY-III-28A型垂直电泳槽，凝胶厚度1.5cm，每管加样量随同工酶不同而不等（30 – 50 μL），以溴酚蓝作前沿指示剂，于4℃冰箱中进行电泳．开始电泳时样品槽稳定电流为1 mA/管，当溴酚蓝进入分离胶界面时样品槽稳定电流为2 mA/管．

表1 凝胶浓度及缓冲系统

以上采用相同的电极缓冲液[Tris-Gly缓冲液（pH8.3），6 g Tris，28.8 g Gly，定容至1 L，用时稀释10倍]进行电泳．电泳时间为4 h．

1.4 染 色

当溴酚蓝指示带距末端约1cm处时结束电泳，并立即拆板，小心地将凝胶取出，用重蒸水清洗2遍，再放入配制好的染色液中进行染色．染色方法基本参照文献[5]．

1.5 结果处理

染色后的凝胶板立即拍照，并绘制电泳结果模式图，计算各酶带的相对迁移率．

1.5.1 酶位点与等位基因编号

基因座位和等位基因的命名基本采用Shaklee等[6]推荐的方法予以编号，以同工酶的缩写字母代表等位基因，小写字母代表编码基因．各座位按其编码酶从阴极到阳极的迁移顺序命名（1、2、3、…），若该座位有1个以上等位基因，各等位基因按英文字母顺序命名（a、b、c、…）．1.5.2 数据分析

本实验以中国水蛇中9种同工酶的酶谱为基础对其进行酶谱相似系数和多态位点比例的计算．酶谱相似系数（C）指2个样品之间共同具有的酶带数与2个样品所具有酶带数之和的比值．其计算公式：C = [2 × W / (a + b)] × 100．其中：W表示样品A和样品B中相同的酶带数；a和b分别表示样品A和样品B的酶带数．若样品个体间在同工酶的表达上不存在差异，则酶谱相似系数不做计算．基因变异度量用多态位点比例（P）表示，P =（多态位点数/总位点数）× 100%．

2 结果与分析

2.1 酶谱分析

2.1.1 苹果酸脱氢酶（MDH：E.C.1.1.1.37）酶谱分析

中国水蛇雌雄个体MDH同工酶酶谱见图1，相似系数总和见表2．

MDH为二聚体酶．雌雄不同个体的酶谱均显示了3个活性区域，表示在中国水蛇中MDH 由3个基因座位编码，均为多态，共编码6 – 9条酶带．Mdh-1座位基因型为a/a、b/b和c/c，其中雌性大多个体缺失a/a，雄性仅2个个体缺失a/a；b/b和c/c雌雄个体表达无差异．Mdh-2座位基因型分别为a/a和b/b，雌性个体普遍缺失b/b，雄性个体表达无差异；a/a雌雄个体表达无差异．Mdh-3座位基因分别为a/a、b/b和c/c，雌性3个个体缺失a/a，雄性个体表达无差异；b/b和c/c雌雄个体表达无差异．中国水蛇雌性个体间MDH同工酶的表达上存在一定程度的差异，而雄性个体间较稳定；表明雌雄在MDH同工酶的表达上呈现一定程度差异．

图1 中国水蛇苹果酸脱氢酶同工酶谱及模式图①编号1 – 10为雌性个体, 11 – 20为雄性个体. 下同.

2.1.2 苹果酸酶（ME：E.C.1.1.1.40）酶谱分析

中国水蛇雌雄个体ME同工酶酶谱见图2，相似系数总和见表2．

ME为四聚体酶．雌雄不同个体酶谱均显示了2个活性区域，表示在中国水蛇中ME均由2个基因座位编码，均为多态，共编码5 – 6条酶带．Me-1基因型为a/a、b/b、c/c、d/d和e/e．其中a/a和b/b雌雄均无缺失，小部分雌性个体及全部的雄性个体缺失c/c，除雌性个体4缺失d/d外，其余雌雄个体的d/d和e/e均无缺失现象．Me-2座位基因型为a/a和b/b，雌性个体大多缺失a/a且个体6还缺失b/b，雄性个体无缺失现象且表达无差异．由此分析得，中国水蛇不同雌性个体在该同工酶的表达上存有一定差异而雄性个体在该酶的表达上基本无差异；表明雌雄间在ME同工酶的表达上呈现一定程度差异．

图2 中国水蛇苹果酸酶同工酶谱及模式图

2.1.3 醇脱氢酶（ADH：E.C.1.1.1.1）酶谱分析

中国水蛇雌雄个体ADH同工酶酶谱见图3．

ADH为二聚体酶．雌雄不同个体的酶谱均显现了3个活性区域，表示在中国水蛇中ADH由3个基因座位编码，均为单态纯合，基因型均为a/a，雌雄20个个体的表达均无缺失，其中Adh-3 a/a酶活性相对稍强．中国水蛇雌雄不同个体间和雌雄间在该同工酶的表达上无差异．

图3 中国水蛇醇脱氢酶同工酶谱及模式图

2.1.4 谷氨酸脱氢酶（GDH：C.E.1.4.1.2）酶谱分析

中国水蛇雌雄个体GDH同工酶酶谱见图4，相似系数总和见表2．

GDH为二聚体酶．雌雄不同个体的酶谱均显现了3个活性区域，表示在中国水蛇中GDH由3个基因座位编码，均为单态纯合，共编码3条酶带．除雌性个体6缺失Gdh-3 a/a外，其余雌雄不同个体均无缺失现象，GDH酶谱表型基本相同．由此分析得，中国水蛇雌性个体在该同工酶表达略有差异而雄性个体在该同工酶的表达上基本无差异．

图4 中国水蛇谷氨酸脱氢酶同工酶谱及模式图

2.1.5 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH：E.C.1.1.1.49）酶谱分析

中国水蛇雌雄个体G6PDH同工酶酶谱见图5，相似系数总和见表2．

G6PDH为二聚体酶．雌雄不同个体的酶谱均显示了3个活性区域，表示雌雄个体的G6PDH均由3个基因座位编码．G6pdh-1和G6pdh-2座位均为单态纯合，雌性个体这两个座位均无缺失，雄性个体中的11、12、13、15、16和20缺失G6pdh-1座位，G6pdh-2雄性个体亦无缺失．G6pdh-3位点为多态，编码1 – 2条酶带，雌性个体8及雄性个体17、18和19均缺失b/b．由此分析得，中国水蛇在该同工酶表达上，雌性个体间不存在明显差异，雄性个体间具一定差异；雌雄总体间也具一定差异．

图5 中国水蛇葡萄糖-6-磷酸脱氢酶同工酶谱及模式图

2.1.6 酯酶（EST：E.C.3.11.1.1）酶谱分析

中国水蛇雌雄个体EST同工酶酶谱见图6，相似系数总和见表2．

雌雄不同个体的酶谱均显示了4个活性区域，表示中国水蛇中EST均由4个基因座位编码，均为多态，其中Est-4位点编码的酶活性相对较强．Est-1和Est-2座位各编码2条酶带，基因型均为a/a和b/b，雌雄不同个体间和雌雄总体间的表达均无差异，亦无缺失．Est-3座位编码3 – 4条酶带，具4个基因型：a/a、b/b、c/c和d/d，雌性个体全部缺失a/a，不同个体间表达无差异；雄性中除个体12外均缺失a/a，个体12缺失c/c而其余个体则不缺失，故雄性中除个体12外，其余不同个体的表达无差异．Est-4座位编码1 – 2条酶带，基因型为a/a和b/b．雌性个体中有半数缺失a/a，雄性中除个体12外均缺失a/a．由此分析得，中国水蛇在EST同工酶的表达上，雌雄不同个体间具一定差异，相对而言，雄性个体间除个体12外其余基本无差异，雌性个体间差异稍大；雌雄总体间亦有一定差异．

图6 中国水蛇酯酶同工酶谱及模式图

2.1.7 乳酸脱氢酶（LDH：E.C.1.1.1.27）酶谱分析

中国水蛇雌雄个体LDH同工酶酶谱见图7．

LDH为四聚体酶．不同雌雄个体的酶谱均显示了1个活性区域，表示在中国水蛇中LDH由1个基因座位编码，共编码5条酶带，基因型均为a/a、b/b、c/c、d/d和e/e，20个个体均无缺失．中国水蛇雌雄个体间和雌雄总体间在该同工酶表达上无差异．

图7 中国水蛇乳酸脱氢酶同工酶谱及模式图

2.1.8 超氧化物歧化酶（SOD：E.C.1.1.1.1）酶谱分析

中国水蛇雌雄个体SOD同工酶酶谱见图8．

SOD为二聚体酶．不同雌雄个体的酶谱均显示了4个活性区域，表示在中国水蛇中SOD由4个基因座位编码，均为多态．Sod-1和Sod-2分别编码3条酶带，基因型均为a/a、b/b和c/c，雌雄不同个体均无缺失，表达无差异．Sod-3编码2 – 3条酶带，基因型为a/a、b/b和c/c．其中雌性个体全部缺失c/c，雌性及雄性不同个体间的表达亦无差异．Sod-4座位编码2条酶带，基因型为a/a和b/b，雌雄不同个体均无缺失，表达也无差异．因此，中国水蛇雌雄个体间在该同工酶表达上不存有差异，而雌雄总体间在该同工酶表达稍有差异，故谱相似系数不做计算．

图8 中国水蛇超氧化物歧化酶同工酶谱及模式图

2.1.9 过氧化物酶（POD：E.C.1.11.1.7）酶谱分析

中国水蛇雌雄个体POD同工酶酶谱见图9，相似系数总和见表2．

POD为二聚体酶．不同雌雄个体的酶谱显示均有4个活性区域，表示在中国水蛇中POD由4个基因座位编码， Pod-1和Pod-2座位均为多态．其中，Pod-1座位编码3条酶带，基因型为a/a、b/b和c/c，雌性个体3缺失该基因座位，其余雌雄个体的表达都没有差异．Pod-2座位编码1 – 2条酶带，基因型分别为为a/a和b/b，雄性个体均缺失b/b，雌雄不同个体间表达亦无差异．Pod-3 和Pod-4基因座位各编码1条酶带，均为单态纯合，其中Pod-3为雄性个体所特有．由此分析得，雌性中国水蛇除个体3外在该同工酶的表达上不存在差异，雄性不同个体间不存在差异，而雌雄总体间具一定差异．

图9 中国水蛇过氧化物酶同工酶谱及模式图

表2 同工酶谱相似系数总和

15 986.66 100.00 100.00 885.72 982.35 100.00 16 986.66 100.00 100.00 852.39 982.35 100.00 17 986.66 100.00 100.00 785.73 982.35 100.00 18 986.66 100.00 100.00 785.73 982.35 100.00 19 986.66 100.00 100.00 785.73 982.35 100.00 20 986.66 100.00 100.00 885.72 982.35 100.00

2.2 多态座位分析

由以上数据综合分析得，中国水蛇群体9种同工酶共记录了31个基因座位、58个等位基因，其中有16个基因座位（Mdh-1、Mdh-2、Mdh-3、Me-1、Me-2、G6pdh-3、Est-1、Est-2、Est-3、Est-4、Sod-1、Sod-2、Sod-3、Sod-4、Pod-1和Pod-2）为多态，具体数据信息见表3．多态座位比例（P）为51.6﹪．以上现象说明中国水蛇中变异现象较为普遍．

表3 多态座位与等位基因统计

3 讨 论

蛇类LDH和EST两种同工酶具有种间差异性和组织特异性[7-11]，这些研究认为酶在不同种间表达的差异可作为识别物种的生化指标，而酶表达的组织特异性说明了不同组织在代谢上的差异．蛇类不同生理期的同工酶表达存在种间差异，任文华等[12]认为红点锦蛇（Elaphe rufodorsata）肝和骨骼肌中的LDH在活动期和冬眠期具有明显差异，而黑眉锦蛇（Elaphe taeniura）和赤链蛇（Dinodon rufozonatum）则未表现出明显变化．由于LDH在糖代谢过程中的重要作用，其研究为探讨动物冬眠时期的糖代谢规律提供一定的依据．

中国水蛇雌雄两性肌肉的ADH和LDH两种同工酶的酶带表达不存在差异，雌性个体的SOD、雄性个体的ME、GDH、SOD和POD表达上基本无差异；但雌性个体间的MDH和ME、雄性个体间的G6PDH存在一定程度的差异．说明中国水蛇个体间及雌雄间均具一定的遗传差异，具一定的遗传变异能力．

许多研究表明，人工繁殖群体遗传变异水平要低于野生群体水平[13-16]．中国水蛇肌肉9种同工酶的多态座位比例（P）达51.6﹪，在人工养殖过程中，养殖群体基因库将不可避免地会丧失某些特定的等位基因．因此，中国水蛇人工养殖时，亲本数量要大，并以自然种群定期更换或者补充繁殖用的亲本．这些措施有助于保持乃至增加中国水蛇人工繁殖种群遗传变异性．

同工酶对中国水蛇生化遗传结构的研究以及对其进行变异分析，将在一定程度上有助于对中国水蛇遗传多样性的全面了解，对中国水蛇种群的人工养殖和物种资源的合理开发，具有重要的意义．

[1] 龚大洁, 周开亚. 同工酶及其在爬行动物系统学中的应用[J]. 西北师范大学学报: 自然科学版, 1999, 35(1):111-116.

[2] 韩雅莉, 肖湘, Lazell J, 等. 蜥蜴目同工酶表型效应与目内物种及种群间亲缘关系的研究[J]. 遗传, 2002, 24(6): 670-674.

[3] 赵尔宓, 黄美华, 宗愉, 等. 中国动物志: 爬行纲, 有鳞目, 蛇亚目[M]. 北京: 科学出版社, 1998: 175-176.

[4] 胡能书, 万贤国. 同工酶技术及其应用[M]. 长沙: 湖南科技出版社, 1985: 11-12, 41-47.

[5] 王中仁. 植物等位酶分析[M]. 北京: 科学出版社, 1996: 95-106.

[6] Shaklee J B, Kepes K L, Whitt G S. Specialized Lactate Dehydrogenase Isozymes: the Molecular and Genetic Basis for the Unique Eye and Liver LDHs of Teleost Fishes [J]. Journal of Experimental Zoology, 1973, 185: 217-240.

[7] 聂刘旺, 郭超文, 吴孝兵. 游蛇科五种蛇四种组织LDH同工酶凝胶电泳分析[J]. 动物学研究, 1995, 16(1): 31-36.

[8] 李新宏, 赵文阁. 黑龙江省七种蛇乳酸脱氢酶和酯酶同工酶比较研究[J]. 哈尔滨师范大学学报: 自然科学版, 1998, 14(1): 64-70.

[9] 刘鹏, 孙玉刚, 赵文阁. 黑龙江省三种蝮蛇不同组织乳酸脱氢酶和酯酶同工酶的研究[J]. 哈尔滨师范大学学报:自然科学版, 2007, 23(1): 80-82.

[10] 邵邻相. 乌梢蛇LDH同工酶谱系的研究[J]. 四川动物, 2000, 19(4): 234.

[11] 杨章民, 方荣盛. 陕西种蝮蛇血清及酯酶同工酶研究[J]. 西北大学学报: 自然科学版, 2001, 31(4): 339-341.

[12] 任文华, 杨光, 谷宇, 等. 刺猬和三种游蛇科动物冬眠期和活动期乳酸脱氢酶同工酶的比较[J]. 南京师范大学学报: 自然科学版, 2002, 25(1): 20-23.

[13] 王伟继, 孔杰, 庄志猛, 等. 真鲷野生群体和人工繁殖群体的同工酶遗传差异[J]. 生物多样性, 2000, 8(4): 391-396.

[14] 孟宪红, 孔杰, 庄志猛, 等. 真鲷自然群体和人工繁殖群体的遗传多样性[J]. 生物多样性, 2000, 8(3): 248-252.

[15] 全成干, 王军, 丁少雄, 等. 大黄鱼养殖群体遗传多样性的同工酶[J]. 厦门大学学报: 自然科学版, 1999, 38(4): 584-588.

[16] 吴力钊, 王祖熊. 长江中游草鱼天然种群的生化遗传结构及变异[J]. 遗传学报, 1992, 19(3): 221-227.

Comparison of Biochemical and Genetic Characteristics in Male and Female Enhydris chinensis

JIA Shouju1, ZHAO Bo2, SHEN Silei1, ZHANG Yongpu1
(1. College of Life and Environmental Sciences, Wenzhou University, Wenzhou, China 325027; 2. College of Biological Sciences, China Agricultural University, Beijing 100193)

By using isozyme electrophoresis on vertical gradient gel of polyacrylamide, nine isozymes [Malate Dehydrogenase (MDH), Malic Enzyme (ME), Superoxide Dismutase (SOD), Peroxidase (POD), Esterase (EST), Lactate Dehydrogenase (LDH), Alcohol Dehydrogenase (ADH), Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase (G6PDH), and Glutamate Dehydrogenase (GDH)] of different individuals of male and female Enhydris chinensis had been analyzed. These isozymes were encoded by 31 allozyme loci and 58 alleles, 16 loci of which were polymorphic: Mdh-1, Mdh-2, Mdh-3, Me-1, Me-2, G6pdh-3, Est-1, Est-2, Est-3, Est-4, Sod-1, Sod-2, Sod-3, Sod-4, Pod-1 and Pod-2. The percentage of polymerphic loci was 51.6%. The results showed that there are no differences in the expressions of ADH and LDH between the male and female Enhydris chinensis with the other seven isoenzymes having differences to different degrees while there are no differences in the expression of ADH, LDH and SOD among the female Enhydris chinensis and no differences in the expression of ME, ADH, GDH, LDH, SOD and POD among the male Enhydris chinensis.

Enhydris chinensis; Isozyme; Biochemical and Genetic Characteristics; Sex

Q55

A

1674-3563(2012)05-0008-10

10.3875/j.issn.1674-3563.2012.05.002 本文的PDF文件可以从xuebao.wzu.edu.cn获得

(编辑：王一芳)

2012-04-25

贾守菊(1956- )，女，北京人，副教授，学士，研究方向：生理生化．† 通讯作者，zhangypu@126.com