同工酶检测方法及其研究进展

杨光瑞，洪 霞，何海宁，安小苹，安 娜，袁顺捷，金 莹，杨菊梅

(1.甘肃省商业科技研究所，甘肃兰州 730010；2.甘肃中商食品质量检验检测有限公司，甘肃兰州 730010；3.兰州大学第二医院，甘肃兰州 730000)

同工酶是在长期的生物进化中，生物体为适应环境而形成的由不同基因或等位基因编码的一类能够催化相同化学反应、结构不同的蛋白质[1]。自1959年Marker等[2]提出同工酶概念以来，同工酶分析技术发展已接近60年了。迄今为止，已发现并研究的同工酶多达几百种，经常运用的同工酶有肌酸激酶同工酶、过氧化物同工酶、酯酶同工酶、超氧化物气化歧化酶、脱氢酶同工酶、过氧化氢酶同工酶等[3-5]。随着生物技术和分子生物学的快速发展，同工酶分析技术在动物、植物、微生物、农业和医学等方面都取得了十分显著的成果，如利用肌酸激酶同工酶作为生物标记物进行疾病的临床诊断、过氧化物酶同工酶和酯酶同工酶物种遗传多样性分析和种质鉴别等[3-6]。此外，同工酶检测技术为分析生物繁殖、体细胞杂交、染色体倍性、基因分化和表达、生物多样性保护等提供了一个新的途径[7-9]，具有非常广阔的应用前景。笔者对近年来同工酶检测技术的发展和同工酶在动植物种质资源鉴定、疾病的临床诊断等主要应用领域的现状进行了总结，并对同工酶检测今后的发展前景进行了展望，以期为同工酶检测在更多领域中的应用和进一步发展提供理论依据。

1 同工酶的检测方法

1.1琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳进行同工酶的分析，主要是利用琼脂糖的分子筛作用，在电场力的作用下将分子量大小不同的同工酶分子进行分离[10]。该方法与聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)相比，凝胶制备过程简单，电泳时间短，能够筛选出不同活性的酶，但其不论是分辨率还是分离效果均不如PAGE凝胶[11]。黄孝湘等[12]利用琼脂糖凝胶电泳方法分析了孝感市池塘静水和桥下流水中生活的克氏原螯虾主要组织的LDH 同工酶谱，结果表明，克氏原鳌虾不同组织中LDH同工酶谱存在差异；进一步根据同工酶条带染色深浅，判断出流水中克氏原螯虾组织的LDH同工酶活性强于静水。

1.2非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)检测Native-PAGE电泳也叫活性电泳，该电泳体系中不添加十二烷基磺酸钠(SDS)和β-巯基乙醇，将有活性的同工酶蛋白直接进行电泳[13]。利用凝胶的分子筛效应和蛋白的电荷效应进行分离，在电泳过程中并不破坏蛋白质的天然构象及其亚基间的相互作用。因此，在电泳结束后，蛋白仍能保持其活性[13-14]。在电泳结束后，将凝胶块在适宜的条件下与特异性底物进行显色反应，便可在凝胶中观察到同工酶特异性条带。该方法是目前同工酶分离提纯和检测的常用方法，其优点在于分离到有活性同工酶蛋白仍具有活性，得到的同工酶谱带具有很强的专一性，结果易于观察[15]。但由于同工酶在凝胶中的迁移率与其分子量和所带电荷呈正相关，在电泳过程中很可能由分子量所导致的迁移率被电荷导致的迁移率所补偿，造成结果不准确。此外，Native-PAGE电泳过程必须在低温下进行，以确保酶活性。尹明华等[16]运用该方法对江西铅山红芽芋低温疗法脱毒苗的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)同工酶谱进行测定，发现在脱毒苗中得到的同工酶谱带与大田苗谱带一致，证明了红芽芋低温疗法脱毒苗具有很高的遗传稳定性，无遗传变异。

1.3变性-复性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳检测SDS-PAGE电泳的变性过程是利用SDS与同工酶多肽分子结合而实现的[15]。SDS分子携带大量的负电荷，当其结合在同工酶多肽分子中时，掩蔽了同工酶分子本身所携带的电荷，消除了电荷对同工酶电泳迁移率的影响[12]，再利用聚丙烯酰胺凝胶的分子筛作用，将分子质量有差异的同工酶分离。但由于SDS是一种可逆的变性剂，由它所导致的变性，在电泳完毕后加入TritonX-100除去SDS，变性的同工酶便可重新恢复活性，再与相应的底物进行染色反应，便可达到检测目的[15]。该方法的优点在于SDS的引入消除了同工酶本身所携带的电荷对电泳迁移率的影响，电泳过程无需在低温下进行。缺点在于在电泳完毕后要对蛋白质进行复性，操作比较繁琐。该方法仍是目前同工酶检测最常用的方法之一[12，15]。廖海等[17]利用该方法对5种菖蒲属植物中过氧化物酶(POD)同工酶进行分离，结果发现，利用该方法得到了含有6条POD同工酶带，而传统的分析方法只得到了5条POD同工酶带。

1.4双向凝胶电泳检测双向凝胶电泳是利用蛋白质的等电点和相对分子量的差异进行分离，具体的操作方法是将同工酶样品根据等电点大小进行第1向分离；再将已完成第1向分离的酶分子以垂直于第1向的方向按照分子量大小进行第2向电泳，得到双向分离的同工酶图谱[13]。该方法的优点在于其分辨率和分离效果优于其他任何单向电泳，缺点在于所分离同工酶常常容易失活，尤其不适用于碱性同工酶的分析[18-19]。张少丽等[19]利用双向凝胶电泳对大白菜温敏雄性不育系TsCMS7311(A)及其保持系7311(B)的小花蕾的β-酯酶同工酶带区进行分析，结果发现，保持系B和转化后的不育系AT在经过第1向电泳后均具有2条特异性β-酯酶同工酶谱带，而在经过第2向电泳后各得到了6个β-酯酶同工酶特异性条带。

2 同工酶分析技术的应用

2.1同工酶在植物水平遗传多样性分析中的应用同工酶作为基因表达的直接产物，其差异性反映了基因表达的差异性，因此对生物体同工酶谱的分析可间接获得基因层面的差异[7，9]。同工酶除了具有物种和组织特异性外还具有高度保守性，同一物种的相同组织中同工酶谱具有很高的相似度，是研究种间和种内遗传多样性的重要手段[20-21]。过氧化物酶(POD)同工酶广泛存在于植物组织中，具有很强的氧化还原活性，参与植物体内许多催化反应。在不同植物和同一植物不同的生长阶段POD同工酶的活性和数目差异很大，因此它能够很大程度上反映植物生长、代谢特点、品种之间的遗传差异。同时，POD同工酶图谱在一定条件下较为稳定，具有种属特异性，是一种良好遗传标记物，目前已被广泛应用于植物种质鉴定、遗传多样性分析[22-24]。马永平等[25]对宁夏枸杞和黑果枸杞中过氧化物酶(POD)、酯酶(EST)及超氧化物歧化酶(SOD)同工酶酶谱进行分析，结果发现在这2种枸杞中，EST和SOD同工酶酶谱所包含的遗传信息有限，而POD同工酶酶谱所携带的遗传信息丰富且差异显著，因而POD可作为枸杞同工酶遗传多样性分子标记。李淑娟等[26]对三江源自然保护区的6个野生种10个居群的鹅观草属进行POD同工酶谱带特征分析，结果表明，三江源地区鹅观草属植物遗传多样性丰富，不同种间POD 同工酶酶谱特征及相似程度上均有一定差异，同一物种的不同居群间酶谱既具有较稳定的相似性，又具有细微差异。

除POD外，目前已有多种同工酶已作为分子标记用于评价植物遗传变异性、亲缘关系和种系发生等方面，并取得了很好的效果[21]。肖慧等[27]对文山三七等5种三七的POD、EST和乳酸脱氢酶(LDH)等6种同工酶谱进行分析，根据同工酶酶谱所得的遗传距离结果，发现黄果三七、紫果三七和广西三七的遗传关系较近，而文山与广西三七的遗传关系相对较远。

同工酶氨基酸序列受基因控制，而表达结果受遗传和环境的双重影响，其氨基酸分子改变，导致蛋白组结构、带电荷量、电泳迁移率改变，因而使其在揭示群体之间和群体内的遗传变异、亲缘关系等方面具有显著的优势。此外还可通过共显性同工酶数据中每个位点的等位基因的有效数量、杂合性和多态性对植物遗传变异进行评估。El-Esawi等[28]利用酸性磷酸酶(ACP)、过氧化氢酶(CAT)及EST同工酶酶谱研究了莴苣的遗传变异、种群结构和亲缘关系，结果表明，同工酶系统共显示16个位点，共31个等位基因；在这16个位点中，11个多态性；种间遗传分化(F-ST)表明，种间同工酶变异占51.3%，种间遗传变异占48.7%；总杂合度(H-T)和附加内遗传多样性(H-S)的平均值分别为0.352和0.171；间遗传多样性(D-ST)为0～0.424，平均为0.180；该结果证明了莴苣多起源的假说。因此，这种高度的遗传变异证明同工酶对莴苣的多态性分析是有效的。Ahmed等[29]采用同工酶分析技术，对沙特阿拉伯的7种茄属植物的遗传变异及亲缘关系进行研究，结果发现，茄属植物多态位点的比例从黑穗病菌的0.87位点到白穗病菌的0.80位点，平均杂合度在0～1.00，平均期望杂合度在0～0.50；该结果证实了所研究的茄属植物具有广泛的遗传多样性。

2.2同工酶在疾病诊断和监测中的应用同工酶具有器官特异性，特定的同工酶只在特定的器官组织发挥作用，当其发生变化时，则预示着组织病变或其他不正常的变化[30-31]。通过对这些同工酶的检测，可迅速定位病变组织和疾病的类型，为临床疾病的诊断提供了重要依据[29-32]。肌酸激酶(CK)及其同工酶CK-MB是目前国内外常用于临床诊断心肌是否发生病变的重要酶学检测指标[33]。此外，对丙酮酸激酶同工酶M2(PKM2)、乳酸脱氢酶(LDH)及其同工酶等同工酶的研究结果也预示着同工酶在未来可能作为重要的疾病诊断的检测指标[34]。Lu等[35]研究了丙酮酸激酶同工酶M2(PKM2)的表达对肝癌的临床特征及预后的影响，结果表明，PKM2高表达组(≥11.25%)与PKM2低表达组(<11.25%)相比，肌酐水平显著降低(P=0.043)，胎蛋白水平显著升高(P<0.001)；同时，PKM2表达高的患者与PKM2表达低的患者相比预后差；该研究为今后研究肝癌的发病机制和药物发现提供了有价值的信息。林娜等[36]对血清乳酸脱氢酶(LDH)及其同工酶M、H亚单位值在复治多发性骨髓瘤(MM)中的作用进行研究，结果表明，对于复治复发性骨髓瘤患者，血清LDH同工酶与ISS分期及肾功损害的程度密切相关，LDH同工酶测定比总LDH活性更具有临床价值。乳酸脱氢酶主要催化乳酸和丙酮酸之间的相互转换，在癌细胞有氧糖酵解代谢途径中扮演关键角色。LDH同工酶家族成员的特征、基因表达及其在肿瘤诊断中具有十分重要的意义[37]。许多研究者也致力于同工酶在禽类疾病检测方面的应用，并取得了显著的成果。李杨等[38]采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳检测技术，对乳酸脱氢酶(LDH)、葡萄糖磷酸异构酶(GPI)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)等同工酶酶谱进行了分析，并结合3株柔嫩艾美耳球虫的耐药情况，发现敏感株与耐药株之间的3种同工酶酶谱存在差异，敏感株间无差异，耐药株间有差异，同时各酶的结果也不一致。说明在建立参考株与单一药物耐药株同工酶酶谱的情况下，可以用同工酶检测法对球虫进行耐药性检测。

2.3同工酶在种质鉴定中的应用同工酶中氨基酸的排列顺序决定了同工酶的种类，而氨基酸的排列顺序是由编码该蛋白的基因决定的，因此蛋白变化能反映DNA分子水平上的变化，同工酶分析是蛋白质分子水平上研究物种遗传分化、分析鉴定的有效手段。王晗等[6]对黑龙江省主栽的2个黑木耳品种采集的10个不同地区引种的栽培菌株进行了EST同工酶酶谱多样性比较研究，结果表明，10个菌株EST同工酶酶谱共有8条谱带，相似酶带较多，相似系数在0.81～1.00；在相似水平为0.81时，可将10个菌株分为3个组群，第1组群包括8个菌株，第2、第3组群各1个菌株，同一品种不同来源引种的菌株酶谱差异显著，而不同品种的酶谱却无差异，表明用种市场菌种名称较为混乱。郭海林等[39]对结缕草属14个杂交组合的亲本与后代的POD与EST同工酶酶谱进行分析，结果表明，结缕草的杂交后代在酶带数目以及酶带活性强弱方面与双亲存在较大的差异，而且还出现了数量不等的双亲所没有的“特征酶带”；在所鉴定的44个后代中，有25个后代具有父本的特征带，2个后代具有其他任何材料均没有的一条特征带，这27个后代可以初步鉴定为真杂种。陶芳等[40]分析了杂交水稻不同发育时期材料、不同取材部位EST的表达，结果表明，3～4 d芽龄的幼苗为最适宜的鉴定时期，取材部位不影响标记酶带的表达，并发现互补型在种子真实性和纯度鉴定中具有一定利用价值。尹明华等[16]利用分析红芽芋低温疗法脱毒苗SOD、POD 和CAT 同工酶酶谱的方式对其遗传稳定性进行了研究，该研究为脱毒苗的遗传稳定性检测提供一些同工酶方面的依据。

3 同工酶检测的发展前景

近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，同工酶分析技术愈加成熟，应用更加广泛，目前该技术已在动植物、微生物、农业生产、医学等众多领域广泛应用。目前，同工酶的检测技术在植物分类研究、种质鉴定和疾病检测方面应用较为广泛。由于植物在差异较大的环境中生长时其形态特征变化很大，因而传统的形态学分类法受到了很大的限制，分子生物学的方法虽然结果准确，可信度高，但其费用较高，试验操作较为复杂，限制了其应用。而同工酶检测技术利用检测基因表达的直接产物的变化，间接反映DNA分子中的变化，其具有组织特异性和物种特异性的特点，且该方法费用低、操作简单、结果易于分析，在物种分类和遗传鉴定方面具有十分可观的应用前景。

从商业化的角度出发，作为蟹中之冠的阳澄湖大闸蟹近年来红遍大江南北，据报道，目前市场上出售的阳澄湖大闸蟹基本都是冒充货，但到目前为止，没有有效的检测方法，给市场监管带来了很大的困难，也给消费者带来了巨大的损失。同工酶在不同生长环境下具有显著的表达差异，因此可通过同工酶检测技术，对阳澄湖大闸蟹进行鉴定，规范市场秩序，保障消费者的利益。此外，近年来，中药材资源的短缺，市场价格飙升，导致大量的不法商贩以次充好，用品质差的药材冒充道地药材，谋取利益。同工酶在种质鉴定中的优势，可用于中药材资源的鉴定。

在医学研究和疾病诊断方面，一般当人们发现患病时已经是中晚期，错过了最佳的治疗阶段，给临床治疗带来了很多麻烦，同时也给患者带来了更多的痛苦。随着研究的深入，越来越多的同工酶与组织病变的关系更加清晰，诊断将更及时、更准确，切实地帮助患者早诊断、早治疗、早治愈。综上所述，同工酶在诸多领域都具有潜在的优势和广阔的应用前景。