肠胃清煎剂对裸鼠大肠癌皮下移植瘤奥沙利铂治疗的增效作用

金泉克 许建华 肖海娟 陆海 余文燕 王国娟 孙珏 范忠泽

大肠癌是世界各国恶性肿瘤中的主要死亡原因之一，在中国，大肠癌的死亡率位居癌症死亡率的第4、5位[1]，而发达地区其死亡率已上升到各种恶性肿瘤中的第3位，上海则已居第二位[2]。奥沙利铂是目前结肠癌的一线化疗用药,虽然奥沙利铂对许多耐顺铂或卡铂的肿瘤细胞仍抑制作用，并且在抗癌活性及毒副反应方面表现出明显的优势，但奥沙利铂耐药问题也成为影响临床疗效的一大难题[3]。笔者的前期研究表明，具有健脾化湿解毒功效的上海中医药大学附属普陀医院制剂肠胃清方可明显提高晚期胃肠道肿瘤患者以铂类为基础的化疗的疗效，明显改善生存质量，延长中位生存期[4,5]。应用笔者所在的课题组建立的奥结肠癌耐药细胞株HCT 116/L-OHP及其亲本株HCT 116进行实验，体外实验研究表明，肠胃清药物血清可通过影响DNA损伤修复途径，提高奥沙利铂抑制肿瘤细胞增殖的效果[6]。本研究在上述工作的基础上，建立HCT 116及HCT 116/L-OHP结肠癌皮下移植瘤模型，进一步观察中药复方肠胃清煎剂对L-OHP抑瘤的增效作用。

1 材料与方法

1.1 细胞系及实验动物

人结肠癌细胞株HCT 116，购于南京凯基生物公司。HCT 116/L-OHP为本实验室自行诱导，对L-OHP耐药倍数达17.00倍。BALB/c裸小鼠80只，4～6周龄，体重(20±2)g，雌雄各半。购自于上海西普尔-必凯实验动物有限公司[生产许可证号为SCXK (沪) 2003-0002]，饲养于上海中医药大学附属普陀医院动物房SPF级动物实验室[动物实验室许可证号为SYXK (沪) 2005-0008]，自由饮食。

1.2 主要试剂及仪器

CELL 240型二氧化碳恒温培养箱(德国贺利氏公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；101-2干燥箱(上海市实验仪器总厂)；95%乙醇(分析纯)(上海振兴化工厂)；奥沙利铂(江苏恒瑞医药股份有限公司)；乙二醇双乙胺醚-N，N’-四乙酸(EDTA)(Sigma公司)。

1.3 中药制备

肠胃清煎剂：由生黄芪30 g、党参15 g、生白术15 g、猪苓24 g、薏苡仁30 g、八月札24 g、野葡萄藤30 g、红藤30 g组成。由上海中医药大学附属普陀医院制剂室熬制成水煎剂，参照人与小鼠等效剂量换算公式，小鼠剂量约合25 g/kg，高剂量组为50 g/kg。煎煮方法：加水浸泡1小时，水煎2次，每次煎煮1.5小时，每次用水量为药材的10倍量，水煎液过滤后浓缩至约150 ml，即为含生药1.33 g/ml的水煎剂。

1.4 人结肠癌耐药细胞株HCT 116/L-OHP的皮下移植瘤的建立

接种方法参考《细胞培养》[7]，取对数生长期HCT 116/L-OHP及HCT 116。将细胞消化后收集到离心管中，然后用磷酸缓冲液(PBS)制成浓度为1×107/ml的细胞悬液。取4～6周龄BALB/C裸鼠6只，体重(20±2)g，雌雄各半。常规消毒裸鼠右前肢的腋部皮下。按2×106个/0.2 ml的细胞数量，接种到裸小鼠的右前肢的腋部皮下，传代14天后，自裸鼠身上剥离肿瘤组织，选取生长状态良好，无破溃的肿瘤组织置于生理盐水中，切成1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块备用。在超净台中，裸鼠常规消毒，用20号套管针接种于裸小鼠背部右侧近前肢皮下。本实验所用肿瘤细胞株为第4代，异位瘤传至第3代为模型。

1.5 L-OHP剂量的确定

最大耐受剂量(maximum tolerated dose，MTD)指动物能够耐受的而不引起动物死亡的最高剂量。通过预实验，确认本研究以裸小鼠对L-OHP 1/2 MTD为实验剂量。参照文献[8]报道，选择健康裸小鼠15只，分设不同的剂量组(30、25、20、15、10 mg/kg)，每组3只动物，每周腹腔注射L-OHP 3次(星期一、三、五)，连续3周，最后确定本研究的MTD，1/2 MTD作为实验剂量。实验结果仅有10 mg/kg组裸鼠均存活，即本研究MTD量。故以5 mg/kg作为实验剂量。见表1。

表1 荷瘤裸鼠L-OHP剂量确定

1.6 动物分组及药物干预

参照《中药新药研制开发技术与方法》[9]。造模成功后，待HCT 116及HCT 116/L-OPH肿瘤生长至50～100 mm3左右，分别将50只裸鼠随机分成5组，每组10只：对照组予以生理盐水灌胃，0.4 ml/次，1天1次，每周5次，并予以生理盐水腹腔注射，隔天1次，每周3次，共3周；肠胃清组，以50 g/kg的肠胃清煎剂予以灌胃，0.4 ml/次，1天1次，每周5次，并予以生理盐水腹腔注射，同前，共3周；L-OPH组予以1/2 MTD L-OPH腹腔注射，隔天1次，每周3次，共3周，生理盐水灌胃同前；肠胃清高、低剂量+L-OPH组，分别按50 g/kg和25 g/kg的肠胃清煎剂予以灌胃，0.4 ml/次，1天1次，每周5次，予以L-OPH 1/2 MTD腹腔注射，隔天1次，每周3次，共3周。

1.7 肿瘤体积的测量

以肿瘤体积的变化，反映药物的疗效。从开始给药当天即用卡尺测量肿瘤大小，每周2次，肿瘤体积以公式〔π/6(w1×w2×w2)〕计算(w1为瘤块最大径，w2为最小径)，根据测定结果描绘肿瘤生长曲线。并以此计算T/C%(T代表实验组肿瘤体积，C代表对照组肿瘤体积)[10]。

1.8 荷瘤小鼠的体重

以体重的减轻反映治疗的毒副作用。体重每周测定3次，直至末次治疗后2周。体重的减轻用公式：开始体重-最轻体重/开始体重×100%计算[11]。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 肠胃清煎剂联合化疗药物对皮下移植瘤瘤体抑制率

瘤体生长曲线表明，肠胃清煎剂及L-OHP均能在一定程度延缓皮下移植瘤的生长，肠胃清联合化疗药物可显著减缓肿瘤的生长，尤以肠胃清高剂量+L-OHP组瘤体生长最为缓慢，见图1、3。肠胃清组、L-OHP组、肠胃清高、低剂量+L-OHP组对荷HCT 116移植瘤小鼠抑瘤率分别为84.48%、56.66%、53.75%、48.32%，以肠胃清煎剂联合L-OHP组明显，与对照组有统计学差异(P<0.01)；对荷HCT 116/L-OHP移植瘤小鼠抑瘤率分别为74.87%、47.90%、43.52%、38.01%，与对照组有统计学差异(P<0.01)；见图2、4。同时联合给药对耐药株皮下异位瘤的抑制率较敏感株增加，其抑制效果明显，在有效治疗剂量中，与肠胃清剂量存在量效关系，见图1-4。

2.2 肠胃清煎剂联合化疗药物对皮下移植瘤荷瘤体重的影响

图1 肠胃清煎剂对HCT 116/L-OHP细胞系皮下移植瘤瘤体生长曲线

图2 肠胃清煎剂对HCT116/L-OHP细胞系皮下移植瘤抑瘤率

图3 肠胃清煎剂对HCT116细胞系皮下移植瘤瘤体生长曲线

图4 肠胃清煎剂对HCT116细胞系皮下移植瘤抑瘤率

两组移植瘤小鼠体重在治疗后，敏感株异位瘤组：对照组体重减轻为2%，肠胃清组、L-OHP组、肠胃清高、低剂量+L-OPH组裸鼠体重减轻分别为5%、9.87%、7%、6.43%，同空白对照组比较具有统计学差异(P<0.05)，见表2；耐药细胞株异位瘤组：对照组体重减轻为2.20%，肠胃清组、L-OHP组、肠胃清高、低剂量+L-OPH组裸鼠体重减轻分别为4.29%、8.77%、3.21%、3.97%，以L-OHP组最为显著，同空白对照组比较具有统计学差异(P<0.05)，两肠胃清煎剂联合化疗作用组荷瘤鼠体重减轻影响均少与化疗组，同对照组比较没有统计学差异(P>0.05)；同L-OHP组比较有统计学差异(P<0.05)。见表3。

表2 肠胃清煎剂对荷HCT116移植瘤小鼠体重变化

注：与对照组相比aP<0.05。

表3 肠胃清煎剂对荷HCT116/L-OHP移植瘤小鼠体重变化

注：与对照组相比aP<0.05，同L-OHP组比较bP<0.05。

3 讨论

近年来中国结肠癌发病率逐渐升高，但临床上肿瘤化疗耐药现象日益严重，影响了患者生存期的延长和生活质量的改善[12]。肿瘤的多药耐药性(MDR)是一个复杂的生物学过程，影响因素和参与机制众多，这也是造成化疗失败的重要原因[13]。临床和实验研究表明，中医药联合化疗可提高化疗的效果，其增效作用不仅表现在非铂类化疗的个体中，而且在以铂类为基础治疗方案的肺癌、卵巢癌等肿瘤中也得到充分体现[14,15]。体内的增效作用，与增加肿瘤化疗的敏感性密切相关，同时与减少肿瘤血管的生成、抑制癌细胞的侵袭转移、调节机体的免疫功能等关联。

大肠癌在中医学中属“积聚”、“肠风”、“下痢”、“脏毒”等范畴，其发病普遍认为涉及二方面因素：一为内因，为正气不足；一是外因，为毒邪损伤肠络，痰瘀凝聚肠道所致。肠胃清方是上海中医药大学附属普陀医院博士生导师范忠泽教授的经验方，主要由生黄芪、白术、猪苓、米仁、八月札、野葡萄藤等组成，具有益气补脾、燥湿理气解毒之功效。对病理确诊的术后复发或未能手术的晚期胃癌、大肠癌患者，在化疗方案的基础上，加用具有健脾化湿解毒作用的中药复方，与单纯化疗组对比，中药复方加化疗组生存质量明显提高，中位生存期明显延长[4,5]。

奥沙利铂(L-OHP)是近年来被推荐的II、III期结直肠癌的一线治疗药物，是继顺铂、卡铂后推出的第三代铂类抗癌药，其特点是对耐顺铂、卡铂细胞株均有显著的抑制作用[16]。本实验通过逐步增加作用于亲代细胞HCT 116的L-OHP浓度与间断大剂量L-OHP作用，建立耐药细胞HCT 116/L-OHP[17]，采用皮下接种的方式建立结肠癌皮下异位瘤模型，观察了肠胃清煎剂对L-OHP治疗结肠癌耐药细胞皮下移植瘤的增效作用。研究结果显示，肠胃清煎剂联合L-OHP组荷瘤小鼠体重减轻影响均少于化疗组，尤其是对HCT 116/L-OHP耐药细胞异位瘤裸鼠体重的减轻影响效果更为显著，表明肠胃清煎剂可以减少L-OHP的毒副作用。同样，肠胃清煎剂具有一定抑制肿瘤生长的能力，在联合化疗药物作用下，其抑制效果明显，以耐药细胞异位瘤体更为显著，表明肠胃清煎剂可以对L-OHP治疗耐药结肠癌具有增敏作用。而且，在有效治疗剂量中，与肠胃清煎剂剂量存在量效关系。

随着对肿瘤多药耐药机制研究的深入，逆转耐药治疗已成为肿瘤治疗的热点之一，而耐药机制的复杂性决定了理想的逆转药物应该具有多靶点效应。中药复发的多靶点特性，在肿瘤治疗中的作用引起了人们的广泛关注，临床实践证明肠胃清煎剂具有良好的减毒增效作用，且体外研究已表明中药逆转耐药的有效性。本研究亦表明，化疗药物联合肠胃清煎剂后，其抑制裸鼠体内耐药皮下移植瘤的作用明显得到增强，其增效作用与增加瘤体内的药物浓度有关，但其具体的作用机制目前尚不明确，有待进一步的研究。

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