冠心病血瘀证与血管紧张素转换酶基因多态性和内皮型一氧化氮合成酶基因G894T变异的关系

李建军 宋曙霞 陈克芳 潘爱珍 黄启辉 梁俊雄 易伟民

血瘀证是冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)的主要证型。证是遗传和环境因素相互作用的病理表现，证与遗传变异间的关系研究甚少，NO与血管紧张素II(AngII)生理作用相反，在血瘀证形成中有重要作用。本文就冠心病血瘀证与血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme，ACE)基因多态性和内皮型一氧化氮合成酶( endothelial nitric oxide synthase，eNOS)基因G894T变异的关系进行探讨。

1 对象与方法

1.1 一般资料

从2010年6月至2011年3月，在广州中山大学附属第二医院共诊治广东籍汉族冠心病患者160例，经中医辨证分为血瘀证和非血瘀证，其中血瘀证组119例，其中男62例，女57例，平均年龄(64.4±10.62)岁。非血瘀证组41例，其中男21例，女20例，平均年龄(59.5±15.52)岁。

1.2 诊断标准

冠心病诊断参照1979年WHO制定的缺血性心肌病“心绞痛”、“心肌梗死”的诊断标准[1]，以患者临床症状，体征和病史结合心电图改变进行诊断，全部病例均经冠状动脉造影。血瘀证诊断根据1986年中国中西医结合学会活血化瘀专业委员会制定的血瘀证诊断标准[2]。

1.3 纳入标准

(1)经冠状动脉造影诊断，符合冠心病诊断标准；(2)符合中医诊断标准。

1.4 排除标准

(1)有严重心、肾、肝、肺功能不全者；(2)半年内有外伤和外科手术史者；(3)合并恶性肿瘤者。

1.5 DNA提取

抽取患者2 ml静脉血，乙二胺四乙酸钠(EDTA)抗凝，参照TaKara Company DNA提取试剂盒抽提基因组DNA。

1.6 ACE基因型检测

上游引物序列5’-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3’，下游引物序列5’-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3’。引物均由达安基因公司合成。PCR反应条件：94℃预变性5分钟→94℃变性30秒→62℃复性30秒→72℃延伸1分钟，32个循环后72℃延伸10分钟结束。取4 ul PCR产物在2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定分型，ACE基因上若存在Alu序列，PCR产物位490 bp，即为插入型(I型)；没有Alu序列，PCR产物为190 bp,为缺失型(D)型，两者都有则为(I/D)型。因此ACE基因型可分为II、I/D、DD三种基因型。

1.7 eNOS基因变异检测

上游引物序列5’-CATGAGGCTCAGCCCCAGAAC-3’，下游引物序列5’-AGTCAATCCCTTTGGTGCTCAC-3’。PCR反应条件：94℃预变性5分钟→94℃变性30秒→60℃复性30秒→72℃延伸1分钟，32个循环后72℃延伸10分钟结束。取4 ul PCR产物在2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定分型，eNOS上若不存在变异，则PCR产物为206 bp，即为GG型，若存在变异序列，PCR产物即为119 bp，87 bp两条带即为TT型，若为GT型则产物出现206 bp,119 bp，87 bp三条带。所有eNOS基因型可分为GG、GT、TT三种基因型。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 冠心病血瘀证组与非血瘀证组ACE基因型分布情况

160例冠心病血瘀证与非血瘀证ACE基因D等位基因及I等位基因分布频率比较χ2= 0.117，P>0.05，两组间无差异，符合Hardy-Weinberg遗传平衡。 冠心病血瘀证和非血瘀证组ACE基因型比较χ2=0.009，P>0.05，两组间无差异。见表1。

2.2 血瘀证组与非血瘀证组eNOS基因型比较

冠心病血瘀证与非血瘀证ACE基因G等位基因、T等位基因分布频率比较χ2=0.427，P>0.05，两组间无差异，符合Hardy-Weinberg遗传平衡。冠心病血瘀证和非血瘀证组eNOS基因型比较χ2=0.78，P>0.05两组间无差异。见表2。

2.3 冠心病血瘀证血管狭窄数与ACE基因型分布比较

比较冠心病血瘀证血管狭窄数与ACE基因DD、I/D、II型分布，血瘀证组DD、I/D型基因患者血管狭窄支数较II型多。选用精确概率法进行统计学分析，χ2=12.96，P<0.05，差异有统计学意义。见表3。

2.4 冠心病血瘀证血管狭窄数与的eNOS基因型分布比较

选用精确概率法进行统计学分析，χ2=8.08，P>0.05，表明冠心病血瘀证各兼证血管狭窄支数与eNOS基因GG、GT、TT型分布无差异。见表4。

2.5 冠心病血瘀证支架数与ACE基因型分布比较

经精确概率法分析，χ2=13.826，P<0.05，冠心病血瘀证支架数与ACE基因DD、I/D、II型分布差异明显。随着支架数的增多，II基因型分布减少。见表5。

2.6 冠心病血瘀证支架数与eNOS基因型分布

选用精确概率法进行统计学分析，χ2=3.9，P>0.05，冠心病血瘀证血管狭窄支数与eNOS基因GG、GT、TT型分布无统计学意义。见表6。

表1 冠心病血瘀证组与非血瘀证组ACE基因型分布

表2 冠心病血瘀证与非血瘀证组eNOS基因型比较

表3 冠心病血瘀证血管狭窄数与ACE基因型分布比较

表4 冠心病血瘀证血管狭窄数与的eNOS基因型分布比较

表5 冠心病血瘀证支架数与ACE基因型分布比较

表6 冠心病血瘀证支架数与eNOS基因型分布比较

3 讨论

冠心病属于中医学“胸痹、心痛”范畴。《素问·脉要精微论》云：“脉者……血之府也……涩则心痛，”强调胸痹心痛病位在心，病机关键在于血脉瘀阻。古今大量以活血化瘀药为主组成的治疗胸痹心痛的有效方剂，在临床实践中也证明了心血瘀阻是胸痹心痛的最主要病理改变。因此，血瘀证是目前研究冠心病证型的热点。而冠心病血瘀证的现代研究多集中在血液流变学、凝血功能、血管内皮功能损伤、炎性介质等诸方面[3-5]，但与遗传因素的关系研究甚少。

现代医学认为，冠心病是多基因遗传与环境因素共同作用的结果。流行病学已证实：冠心病是一种遗传疾病。目前发现一些基因多态性影响脂质代谢、血栓形成、血管舒张、收缩等病理生理过程，与冠心病发生的危险性增加具有密切相关性，其中以血管紧张素转换酶基因多态性，内皮型一氧化氮合酶基因G894T变异的相关性研究较为深入。但结果不一。

ACE主要作用是催化血管紧张素I转化为血管紧张素II，后者具有收缩血管、促进平滑肌增殖、促进血小板粘附和聚集等生理功能；ACE活性受基因调控，人类ACE基因的第16个内含子中存在287 bp的Alu重复序列，具有插入/缺失多态性,含有此片段的称为“I”(Inserxion)，不含此片段的称为“D”(Deletion)。实验发现，DD型者血清ACE水平比II型者高出2倍，I/D型者ACE水平介于DD型及II型中间[6]。NaKai[7]的研究表明，ACE基因缺失型多态性不仅与血清ACE水平相关，并增加冠心病的危险性。云美玲等[8]比较海南汉族150例冠心病患者和150 例汉族正常人ACE基因插入/缺失(I/D)多态性检测观察DD，DI，II基因型频率及等位基因频率，认为ACE基因I/D多态性与汉族冠心病有显著关联，是汉族冠心病的致病的主要基因，ACE缺失多态性是汉族冠心病的独立危险因素。但是，杨忠伟等[9]对新疆地区的类似研究发现，ACE基因多态性与新疆地区汉族冠心病关联性不大。

eNOS是心血管系统合成一氧化氮(NO)的主要酶，NO具有扩张血管、抑制平滑肌细胞增殖、抑制血小板粘附和聚集等生理功能[10]。eNOS基因编码序列第894位碱基发生G突变为T(G894T)变异，可能与冠心病发病相关。Cuilin Zhang等[11]通过对861名糖尿病患者NOS基因G894T基因进行分析,其中220名患有冠心病患者为实验组，641名没有冠心病的患者为对照组，结果发现eNOS基因与冠心病的发生不具有相关性，并不会增加该病的危险性。彭瑾瑜等[12]对103例冠心病患者、104 例对照组eNOS基因G894T多态性的基因型，分析了它对冠心病的影响显示：冠心病组和对照组eNOS基因G894T多态性的等位基因频率差异相显著(P=0.029)，认为冠心病组的eNOS基因G894T突变频率比对照组高，T 等位基因可能与冠心病的发生有一定的关联。但李敏等[13]通过Meta分析得出结论：eNOS基因G894T多态性的TT基因型会增加冠心病的发病危险,认为它可能是冠心病的遗传危险因素之一。

冠心病血瘀证与ACE基因的相关研究国内的结果不甚一致。毛以林等[14]用PCR法检测48例血瘀证和52例非血瘀证冠心病患者及54名健康人的ACE基因型，结果显示冠心病血瘀证组ACE基因DD型及D等位基因频率比非血瘀证组和健康对照组高(P<0.01)；DD型ACE基因可能为冠心病血瘀证发病的易感基因。黄献平等[15]的研究也表明ACE基因DD型和D等位基因的频率增高可能是冠心病心血瘀阻证易感基因型；认为可能与D等位基因导致AngⅡ异常增多有关。但是李杰等[16]在冠心病血瘀证家系中未发现ACE基因I/D多态性与冠心病血瘀证存在明显的相关性，认为该基因座可能不是湖南汉族人群冠心病血瘀证的遗传易患基因，只是冠心病血瘀证的发病危险因素之一。国内对冠心病血瘀证与eNOS基因的相关性研究未见报道。

本研究表明，冠心病血瘀证与非血瘀证ACE基因多态性、eNOS基因变异分布频率无显著差异，提示冠心病血瘀证与ACE基因和eNOS基因变异无明确相关性，说明ACE基因多态性和eNOS基因变异不是冠心病血瘀证的主要遗传因素。但在比较血瘀证组和非血瘀证组血管狭窄支数及PCA支架数时发现ACE基因DD、I/D型较II型增多，间接提示血瘀证严重程度可能与ACE基因DD、I/D变异相关，当冠心病血瘀证有ACE基因DD、I/D变异时，可能存在冠状动脉多支病变，病情严重，与王阶等[17]的研究相一致。本研究的结果还提示，冠心病血瘀证存在复杂的遗传背景，在今后的工作中需应用基因组学、芯片技术进行进一步深入研究。

参考文献

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