白细胞介素10-1082G/A位点单核苷酸多态性与膀胱癌的相关性

陈占国 何 杰 周 武 余志贤 吴秀玲 陶志华

在我国的泌尿系肿瘤中，膀胱肿瘤不论是发生率还是病死率均居首位。研究表明，膀胱肿瘤与环境因素和遗传因素密切相关。IL-10是细胞因子网络中为数不多的免疫抑制因子，具有下调炎症反应的作用。有证据表明IL-10可能参与了膀胱癌的发病机制［1～3］。IL-10的产生与其基因启动子多态性密切相关，IL-10基因启动子区域存在3个SNP位点(-1082G/A、-819C/T和-592 C/A)，其基因型决定血清IL-10的表达量，IL-10基因启动子多态性可能与膀胱癌遗传易感性有关。目前，国内尚无相关报道，国外仅见印度北方人群IL-10基因启动子多态性与膀胱肿瘤遗传易感性的研究报道，且不同地区不同人种IL-10基因启动子SNP位点等位基因频率可能存在差异。本研究采用等位基因特异性扩增(AS-PCR)结合DNA测序方法，检测浙江汉族人群IL-10基因启动子-1082G/A多态性位点，探索IL-10基因启动子-1082G/A多态性与膀胱癌的相关性。

对象与方法

1.对象:(1)病例组400例膀胱癌，来自温州医学院附属第一医院泌尿外科住院患者，2009年1月～2011年3月经病理确诊，其中男性318例，女性82例，患者平均年龄63.05±10.15岁，吸烟者186例，不吸烟者214例;上述病例均为初诊膀胱癌患者，不包括膀胱癌复发患者，未经化疗、放疗，并且无任何其他肿瘤病史;肿瘤组织病理诊断为膀胱移行细胞癌，其中浅表性(Ta期～T1期)为278例，浸润性(T2期～T4期)为122例。(2)对照组400例，来自同期健康体检者，其中男性316例，女性84例，平均年龄62.88±9.52岁，吸烟者180例，不吸烟者220例，无慢性疾病、无泌尿系统疾病、无任何恶性肿瘤家族史，最终排除诊断膀胱肿瘤及其他部位恶性肿瘤。为了具有可比性，病例组和对照组均为浙江汉族人群，彼此之间无血缘关系，年龄、性别构成比相近。全部研究对象经笔者医院伦理委员会同意，签署知情同意书。

2.主要仪器与试剂:Mastercycler PCR扩增仪(德国Eppendorf公司)、DU®800紫外分光光度仪(Beckman-Coulter公司)、DYY-6C电泳仪(北京六一仪器厂)、WD-9413B凝胶成像分析仪(北京六一仪器厂)、血液基因组DNA提取试剂盒和2×Taq PCR MasterMix(北京天根生化科技有限公司)、DNA Marker(MBI Fermentas公司)。

3.方法:(1)基因组DNA制备:抽取患者静脉血2ml(EDTA-K2抗凝)，采用血液基因组DNA抽提试剂盒提取基因组DNA(离心柱式提取)，严格按试剂盒说明书操作，用DU®800紫外分光光度仪进行纯度和DNA定量分析，将DNA溶液稀释至20ng/μl，-20℃储存备用。(2)引物设计与合成:利用PCR引物的3'端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性 PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3'碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，从而检测出突变，该法省去了探针杂交操作;IL-10基因启动子位点-1082G/A的PCR引物参照文献［4］设计，见表1。引物设计完成后，进行BLAST同源性检索，与其他基因无同源性。同时，合成内参引物一对。引物由上海基康生物技术有限公司合成。(3)PCR扩增:IL-10-1082G/A位点的PCR扩增总体积 25.0μl，其中含 2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，10μmol/L 上游 引物 0.75μl，10μmol/L 下游 引物0.75μl，DNA 模板1μl，灭菌双蒸水10μl;IL-10-1082G/A 位点的扩增循环条件:94℃预变性 1min，95℃ 15s、65℃ 50s、72℃ 40s，共 10 个循环;95℃ 20s、62℃ 50s、72℃ 50s，共 20 个循环。每次PCR扩增均设立阴性对照和试剂空白。(4)IL-10-1082G/A位点基因型分析:根据特定的引物对是否能扩增出相应的片段，确定是否存在该等位基因，每个样本同时经两对引物(两个PCR扩增体系)扩增确定基因型。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳确认基因型。内参引物反应体系参照IL-10-1082G/A位点的PCR扩增体系，用于验证每一个所提取基因组DNA标本的有效性。通过对照电泳最终确认基因型。(5)测序验证:为了提高AS-PCR检测IL-10-1082G/A位点检测的准确性，随机盲样抽取10%样本，进行DNA测序，用于验证AS-PCR的可靠性;采用胶回收试剂盒纯化PCR产物，PCR产物纯化和DNA测序交上海桑尼生物科技有限公司完成。

表1 IL-10基因启动子-1082 G/A位点引物序列

4.统计学方法:Hardy-Weinberg平衡检验判断所选取样本的代表性;用SPSS 17.0统计软件包进行统计分析;IL-10-1082G/A位点基因型频率和等位基因频率分布比较采用χ2检验;采用Logistic回归分析判断膀胱癌危险因素作用的大小，以比值比(OR)及95%可信区间(CI)表示相对危险度，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.病例组与对照组的一般情况的比较:膀胱癌病例组和健康对照组在年龄、性别比例、吸烟、饮酒等变量进行比较，分布差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表2。以上所有研究对象，均进行IL-10-1082G/A基因型检测。

2.IL-10-1082G/A位点检测结果及基因型确定:样本分别经G和A引物对扩增后的阳性结果应为258bp;仅见G引物对扩增的片段为GG型，均见相应的片段为GA型，仅见A引物对扩增的片段为AA型;IL-10-1082G/A位点基因型的电泳结果见图1;随机盲样抽取10%样本，进行DNA测序，测序结果与AS-PCR检测的基因型完全一致，证实ASPCR检测结果是可靠的，测序结果见图2。

表2 膀胱癌组与对照组的一般情况的比较［n(%)］

图1 AS-PCR法扩增IL-10-1082G/A位点的基因型

3.IL-10-1082G/A基因型和等位基因频率的分布:膀胱癌组和对照组IL-10-1082G/A的基因型和等位基因频率分布结果，见表3。经χ2检验，膀胱癌组和对照组IL-10-1082G/A SNP位点基因型及等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明其基因频率已达到遗传平衡(P＞0.05)，说明所选取病例组和对照组的人群，具有良好的代表性。膀胱癌组和对照组中基因型比例从高到低分别为AA型＞GA型＞GG型，两组在基因型分布和等位基因频率之间的差异具有统计学意义(χ2=8.375，P＜0.05和 χ2=8.322，P＜0.01)。

图2 IL-10-1082G/A基因型GG型、AG型及AA型的测序图谱(A、B、C)

表3 膀胱癌组和对照组IL-10-1082G/A的基因型和等位基因频率分布［n(%)］

4.IL-10-1082G/A基因型和等位基因与膀胱癌风险性的关系:因GG型例数较少，且与GA型之间没有统计学差别，故将GG型和GA型合并;AA基因型的个体与携带G基因型的个体(GG型和GA型)相比，其患膀胱癌危险性增加2.055倍(OR=2.055，95%CI:1.252～ 3.374)(χ2=8.375，P ＜0.01);携带等位基因A的个体与携带等位基因G的个体相比，其患膀胱癌危险性增加1.990倍(OR=1.990，95%CI:1.237～ 3.203)(χ2=8.322，P ＜0.01)，见表 4。

表4 IL-10-1082G/A基因型和等位基因与膀胱癌的相关性分析［n(%)］

5.IL-10-1082G/A基因型与膀胱癌临床分期的关系:GG型、GA型、AA型在浅表性膀胱癌的分布频率分别为0.4%、5.4%、94.2%，在浸润性膀胱癌的分布频率分别为0%、8.2%、91.8%，将GG型和GA型合并为一组，GG+GA基因型与AA基因型在浅表性膀胱癌与浸润型膀胱癌之间差异均无统计学意义，见表5。

表5 IL-10-1082G/A基因型膀胱癌临床分期的关系［n(%)］

讨 论

研究表明，膀胱癌与遗传因素和环境因素密切相关，遗传因素和环境因素相当于肿瘤发生的内在因素和外在因素，肿瘤的发生是两者共同作用的结果。SNPs是人类基因变异的最普通形式，可能有助于解释不同个体对多种疾病包括癌症的易感性差异。DNA序列中单核苷酸的变异，尤其是基因启动子的突变可能既影响基因表达又能影响酶的活性，就较容易和癌症危险性联系起来。目前已有大量的研究探讨了Ⅰ、Ⅱ相药物代谢酶基因、DNA修复基因多态性与肿瘤易感性的关系［5，6］，这些基因 SNPs与膀胱癌易感性之间存在一些联系，并认为其可能是造成不同个体对所暴露环境因素反应差异的重要原因之一。

近年来，在寻找膀胱癌相关基因时，白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)基因备受关注。IL-10是一种具有多种免疫抑制及刺激功能的重要免疫调节因子，与炎症疾病、自身免疫性疾病以及移植等多种疾病密切相关。IL-10具有明显的抗炎症作用，IL-10表达量的减少会导致前炎症介质增加，长期过量地产生前炎症介质对于促进肿瘤生长和发展起重要的影响，易形成肿瘤发生和发展的适宜微环境。IL-10还可通过下调MHC-Ⅰ表达来抑制肿瘤生长，进而增强自然杀伤细胞(NK细胞)介导的肿瘤杀伤作用。由此可见，IL-10能明显抑制肿瘤的发生。有研究表明，IL-10参与了膀胱癌的发病机制［1～3］。IL-10能明显抑制肿瘤的发生。个体表达IL-10的能力主要取决于其遗传背景。产生IL-10的能力显著不同，其根源在于IL-10基因启动子区的多态性。IL-10基因位于第1号染色体1q31～32，含有5个外显子和4个内含子。IL-10基因的启动子区域有3个多态位点(-1082 G/A、-819C/T、-592 C/A)，导致其mRNA合成率不同，影响IL-10基因表达。启动子区域多态性与IL-10表达水平密切相关，这些基因多态性处于强烈的连锁不平衡状态，3个多态性位点组成了3种单体型(即 GCC、ACC、ATA)，IL-10基因启动子的各基因型分别对应不同的IL-10分泌水平:GCC/GCC为高分泌型，GCC/ACC和 GCC/ATA为中分泌型，ACC/ACC、ACC/ATA和ATA/ATA为低分泌型［7］。

Ahirwar等［8］首次报道北印度人IL-10的基因多态性和膀胱癌遗传易感性的关系，结果显示在膀胱癌病例组中，IL-10-1082G/A基因型频率高低依次为:GA型(52.3%)＞AA型(39.3%)＞GG型(8.4%);在正常对照组中，该SNP位点的基因型频率高低依次为:GA型(47.0%)＞AA型(37.2%)＞GG型(15.8%);其结论是IL-10-1082G/A多态性位点携带A等位基因(GA+AA)，膀胱癌遗传易感性增高。本研究对浙江汉族人群IL-10-1082G/A位点SNP与膀胱癌风险性的关系进行了分析。结果显示，病例组和对照组的AA型比例很高，即在膀胱癌病例组中，基因型频率高低依次为:AA型(93.5%)＞GA型(6.25%)＞GG型(0.25%);在正常对照组中，该SNP位点的基因型频率高低依次为:AA型(87.5%)＞GA型(12.0%)＞GG型(0.5%);IL-10-1082G/A位点的基因型频率和等位基因频率在病例组和对照组间差异存在统计学意义(χ2=8.375，P＜0.01和 χ2=8.322，P ＜0.01)。GG 型在病例组和对照组少见，将GG型GA合并为一组(GG+GA组);对所有样本进行Logistic回归分析，与携带G基因的个体(即GG+GA)相比，AA基因型的个体患膀胱癌的风险增加2.055倍(OR=2.055，95%CI:1.252～3.374)(P＜0.01);与携带等位基因G的个体相比，携带等位基因A的个体患膀胱癌的风险增加1.990倍(OR=1.990，95%CI:1.237～3.203)(P＜0.01)。可见，IL-10-1082G/A位点的基因型AA与个体患膀胱癌的风险性相关。变异型基因型(AA)导致IL-10水平降低，由此推测，IL-10基因转录水平的降低可能影响膀胱癌的发生和发展，IL-10可作为膀胱癌发生和发展的一个重要因素。

不同地区不同人种IL-10基因启动子SNP位点等位基因频率存在差异，IL-10基因多态性位点与不同类型的肿瘤和临床结局密切相关。膀胱肿瘤按照病程进展分为浅表性膀胱癌和浸润性膀胱癌，浸润性膀胱癌病程进展迅速，患者预后差，而浅表性膀胱癌的显著特点是频繁复发，高达70%的患者将在短期内多次出现肿瘤复发，其中30%将进展为更高分期和分级的肿瘤。Ahirwar等［8］发现在高分级高分期的膀胱癌中，携带A等位基因的基因型(GA+AA)比例反而降低，这提示携带A等位基因的IL-10-1082G/A基因位点对膀胱癌有保护性。本研究结果显示，浸润性膀胱癌AA基因型比例低于浅表性膀胱癌，但两组分布差异没有统计学意义(P＞0.05)，该位点基因型与膀胱癌的临床分期没有直接相关。

等位基因特异性扩增法(AS-PCR)检测IL-10-1082G/A基因启动子多态性，该方法是Newton等首先建立用来检测已知突变的方法。其基本原理是:如果引物的3'端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。因此根据已知点突变设计3条引物，其3'端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。此法已用于多种疾病的点突变的检测。具有简便、快速，省去探针杂交，检测成本低等特点。本研究采用AS-PCR结合DNA测序方法检测IL-10基因启动子多态性位点，分析浙江汉族人群IL-10-1082G/A基因启动子多态性与膀胱癌遗传易感性的关系，以期为筛检膀胱癌高风险人群提供科学依据。

总之，IL-10-1082G/A多态性与膀胱癌危险性密切相关，尤其在AA基因型个体中更高的患癌风险。IL-10-1082G/A多态性可能是膀胱癌的一个新的危险因素，可作为新的可能的膀胱癌分子标志物。IL-10-1082G/A位点基因型与膀胱癌的临床分期没有直接相关性。当然，膀胱癌的病因和病理生理机制是复杂多变的，不是单一基因多态性可以解释的，对于其发病机制尚待进一步研究。另外，IL-10基因启动子多态性与血清IL-10及TNF水平的相关性，正在进一步研究中。

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7 吕铁明，谭建明，欧良明，等.细胞因子基因多态性与细胞因子水平关系的研究［J］.中华器官移植杂志，2002，23(5):266-268

8 Ahirwar D，Mandhani A，Mittal RD.Interleukin-10 G-1082A and C-819T polymorphisms as possible molecular markers of urothelial bladder cancer［J］.Arch Med Res，2009，40(2):97-102