化学发光法和放射免疫法检测胰岛素

鲁 彦 岳建云 苑 芳 黄 玮 王成龙 杜 薇

酶联免疫吸附试验(EIA)、放射免疫(RIA)和化学发光(CLIA)技术是当代蛋白质和多肽定量3种重要的检测技术。化学发光技术产生于1977年，是由Halman在放射免疫技术的原理基础之上，将化学发光和免疫反应结合建立起来的方法［1］。ADVIA Centaur发光仪(以下简称CP)是西门子公司收购前德林公司后开发出来的产品。笔者所在科室2010年底装备了西门子ADVIA Centaur化学发光仪。尽管比较化学发光仪和放射免疫检测激素的研究已甚多，但有关CP发光仪检测激素的研究目前不多。因此本研究通过RIA和CP同时检测了52份胰岛素标本，对西门子化学发光仪CP检测结果进行分析和评价。

材料与方法

1.研究对象:笔者医院2011年6～7月胰岛素标本52份，其中男性25人，女性27人，患者平均年龄59.3岁。

2.试剂和设备:RIA使用的设备为中佳合肥科技有限公司生产的γ计数仪，试剂由山东潍坊三维生物工程集团有限公司提供，批号20110720。CLIA检测设备为西门子公司生产的CP化学发光仪，试剂使用西门子公司原装胰岛素试剂，试剂批号:066077。

3.研究方法:所有患者用真空干燥管静脉采血，室温下3800r/min离心15 min，分离血清，-20℃保存备用。RIA和CLIA均由操作熟练的专门技术人员操作。测定前先做质控品，每次测试均带阳性对照、阴性对照和标准品，以保证检测结果的可靠性。

放免法检测基本原理为竞争性放射免疫分析法。血清中的胰岛素和试剂中125I-胰岛素抗原同时与试剂中的胰岛素抗体结合，形成抗原抗体复合物。加入免疫分离剂，将免疫复合物沉淀出来，离心后，抽弃上清，用γ计数仪测量沉淀的放射性计数(cpm)。血清中胰岛素含量越高，试管中cpm值越低，二者呈现反比关系。化学发光法原理为直接化学发光技术。即第一抗体为吖啶酯标记的单克隆鼠抗胰岛素抗体，二抗为固相试剂内共价偶合到顺磁性微粒上的单克隆鼠抗胰岛素抗体。血清中的胰岛素与吖啶酯标记的一抗结合，然后加入固相二抗。血清内胰岛素再与固相内二抗结合，分离未结合的一抗，启动化学发光反应，血清中的胰岛素的含量与系统检测的相对光单位(RLUs)数量呈现一定的直线关系。

4.统计学方法:经过正态性检验和方差齐性检验，本组胰岛素实验结果数据不符合正态分布，故使用中位数表示两种方法检测结果。Wilcoxon配对符号的秩和检验比较两种方法检测结果的差异，Spearman统计表示两种方法的相关性。

结 果

1.RIA和CLIA检测结果比较:为了比较两种检测方法之间有无差异，我们同时用RIA和CLIA法测试了52个标本内胰岛素含量，通过Wilcoxon配对符号的秩和检验比较二者之间有无显著性差异。RIA和CLIA检测胰岛素的中位数分别为33.48和27.50(Z=-3.23，P＜0.01)，认为两种方法检测结果之间有统计学差异。

2.两种方法之间的相关性研究:为了比较CLIA和RIA检测胰岛素结果之间有无相关性，我们用Spearman检测两种方法的相关性，用散点图表示结果(图1)。Spearman相关系数为0.845，认为两种方法检测结果具有高度相关性(P＜0.01)。散点图相关系数为0.92，与Spearman结果一致，认为两种方法之间高度相关(P＜0.05)。

图1 RIA和CLIA检测胰岛素结果散点图(R2=0.92，P ＜0.01)

讨 论

我们的实验结果表明，应用RIA和CLIA检测同一份标本，两个结果之间有显著性差异，但两种方法检测结果之间高度相关。

EIA、RIA和CLIA作为当代蛋白质定量检测的3大技术，具有各自优点和缺点。EIA具有试剂成本低，不需要特殊设备(如果要定量检测需要酶标仪，价格在5万元以内不等)，废液不含放射性核素，对工作人员和环境污染比较小等优点，在大型医院和大部分基层与医院均可使用，应用范围广泛。EIA缺点是检测灵敏度比较低(10-9g/L)，检测微量蛋白质或微量激素结果准确性差［2，3］。近年来发展出来的全自酶联分析仪是EIA方法实现了自动化，但全自动酶联分析仪本身价格昂贵(100万～200万之间)，目前在广大医院难以普及。RIA方法的优点是试剂成本低，检测结果精确性比较高(10-15～ 10-12g/L)［4～6］，但需要γ计数仪(大约10万～20万元不等)。RIA缺点是:①125I等同位素对工作人员和环境产生的放射性污染;②125I半衰期比较短(60天)，试剂稳定性比较差［7］。如果试剂未用完，第2次检测必须重新做曲线，结果准确性也会大大降低。CLIA具有灵敏度高、特异性强、线性范围宽、操作简便，可实现全自动化的优点［8］。应用范围广泛，既可检测抗原、半抗原和抗体，亦可检测核酸。CLIA无辐射、标志物有效期长，因此试剂稳定性好［9，10］。缺点是试剂成本价高，需要特殊设备(设备价格30万～150万不等)。RIA和CLIA均需特殊设备，限制了两种方法的使用，许多基层医院均不能配备γ计数仪和化学发光仪，因此不能应用这两种方法。

笔者所在科室2010年配备了西门子化学发光仪。西门子化学发光仪系收购前德灵技术后开发出的产品。尽管目前比较RIA和CLIA的研究很多，但将CP检测结果和RIA结果进行比较并且评价的研究甚少。因此我们选择52份血清，通过两种方法进行检测，对其结果进行评价。结果表明，CLIA和RIA检测结果不一致，不一致的原因可能是由于:①两种方法的标准品不一致［11］;②化学发光法使用单克隆抗体，放免法使用多克隆抗体。单克隆抗体和多克隆抗体敏感性和特异性不一致;③两种试剂盒分别由不同的厂家生产，使用的抗体片段不完全一致。但两种方法具有高度相关性，因此测试结果具有一定的可靠性。由于条件的限制，无论RIA、CLIA还是EIA均非测定胰岛素的金标准，相互之间对比缺少标准参考条件，限制了CLIA评价的准确性。

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