8-羟基脱氧鸟苷作为DNA氧化损伤标志物在疾病诊断中的应用*

高玉楠 ，杨 靖 ，宋沁馨 ，2，李 博 ，2，陈国华 ，丁 黎 ，2**

中国药科大学 1药物分析教研室；2药物质量与安全预警教育部重点实验室；3药物化学教研室，南京 210009

活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）是机体内一类活性含氧化合物的总称，主要包括超氧阴离子基团、过氧化氢自由基、羟自由基等。ROS对多条细胞内关键信号转导通路有调节作用[1]。静息条件下，机体内的抗氧化系统可以及时地清除多余自由基，维持机体的氧化还原平衡；但在疾病或某些外源性物质刺激下，ROS快速释放并在体内过度蓄积，氧化应激超出机体抗氧化能力，进而造成DNA的氧化损伤。而后者能够产生大量嘌呤羟基化、嘧啶羟基化的碱基修饰产物。

在各种碱基修饰产物中，8-羟基脱氧鸟苷 （8-hydroxy-2′-deoxyguanosine，8-OHdG， 结构见图 1）被公认为是DNA氧化损伤的标志物。其主要原因有两点：（1）8-OHdG只通过DNA氧化损伤途径形成，不是细胞更新产物，不会在系统循环中由dG氧化而成，它为代谢终产物，在体内稳定存在，其在体液中的水平不受饮食等因素影响；（2）8-OHdG可在通过碱基切除、核苷酸切除修复、错配修复及阻止结合[2-3]等多种机体自我保护途径的作用下从DNA链上切除，经尿液排出体外，其半衰期为55 min[2-3]，较其他损伤产物长，方便检测。

图1 8-羟基脱氧鸟苷结构式

在稳态下，排泄出的8-OHdG的量等于氧化损伤新生成的8-OHdG的量，尿中8-OHdG的排泄量等同于DNA氧化损伤率，因此，尿中8-OHdG的排泄量可以反映整个机体平均的氧化损伤率，同时通过分析其在组织细胞核DNA及线粒体DNA中的含量，以反映体内特定部位DNA氧化损伤和机体正常的修复作用。越来越多的研究证明，糖尿病（diabetes mellitus，DM）、癌症、心血管疾病的发病和病情发展都与氧化损伤有着密切的关系，因此8-OHdG不仅是氧化应激的生物标志物，还是肿瘤和糖尿病的危险因子[4]，可用于氧化应激相关疾病的诊断。

1 8-OHdG与糖尿病的诊断

虽然糖尿病及其并发症的具体发病机理仍未明确，但研究证实，氧化应激与糖尿病及其并发症的发生、发展关系密切[5]。

1.1 高血糖症

在高血糖环境下许多组织都会产生大量ROS，这些ROS有可能参与胰岛-β细胞机能异常和胰岛素抵抗。因此，高血糖症（hyperglycemia）患者尿液中8-OHdG排泄量明显增加，8-OHdG排泄量与病患糖化血红蛋白水平（HbA1c）呈正相关[6-7]。在对96例2型糖尿病患者的研究中，Nishikawa等发现HbA1c升高组比正常组尿中含8-OHdG高2.5倍[8]。但研究并未发现8-OHdG水平与其他糖尿病相关变量诸如血压[8-9]、胆固醇[8-9]、甘油三酯有明确的关联[1]。试验还发现，加强胰岛素治疗组8-OHdG尿排泄量明显低于常规胰岛素治疗组[8]。

1.2 糖尿病并发症

8-OHdG的表达可以反映出氧化应激参与2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的发生。 与健康者相比，糖尿病患者体内8-OHdG水平显著增加。氧化应激也参与包括脑病在内的大血管和微血管急慢性并发症的发生，无并发症糖尿病患者与患有糖尿病并发症患者体内8-OHdG水平的差异也常见于各类报道。

1.2.1 糖尿病肾病 （Diabetic Nephropathy，DN）糖尿病肾病是最重要的糖尿病微血管并发症之一。高血糖诱导产生的ROS参与糖尿病微血管并发症的发生，因此评价糖尿病患者的氧化应激状态对于预测糖尿病肾病有重要意义[10]。

糖尿病肾病患者血清中8-OHdG水平显著高于T2DM患者,而T2DM患者又明显高于正常对照组[7，1]。氧化应激的水平直接影响着糖尿病肾病微血管病变的程度，临床糖尿病肾病患者24 h尿8-OHdG排泄量＞早期糖尿病肾病患者，大量蛋白尿组＞微量蛋白尿组，这与Xu等[9]以尿液中8-OHdG作为糖尿病肾病患者DNA氧化损伤研究的结果一致。提示8-OHdG表达明显增高，是肾小球细胞蛋白质氧化应激的指标，可作为研究氧化应激在糖尿病肾病发病机制中作用的检测指标之一[11]。联合使用钙通道抑制剂Azelnipidine和肾素-血管紧张素-醛固酮系统抑制剂，可有效减少糖尿病性肾病患者8-OHdG 排泄量[12-13]。

1.2.2 糖尿病性视网膜病 （diabetic retinopathy，DR）Yoshihiro等[14]在研究糖尿病性视网膜病患者玻璃体中8-OHdG的浓度时发现，患者的浓度明显高于对照组，而有无玻璃体血症状与玻璃体中8-OHdG浓度无显著关联，从而验证玻璃体中8-OHdG浓度提高源于眼部组织ROS产物的增加，而非玻璃体充血由血液带入。Pan等[15]得到8-OHdG在正常对照组、糖尿病组、糖尿病性视网膜病组浓度依次显著增高的结果，从而得出糖尿病的发生由氧化应激导致、氧化应激是糖尿病性视网膜病变的重要危险因素的结论。

1.2.3 糖尿病心肌病 （Diabetic Cardiomyopathy，DC）通过研究101例糖尿病心肌病患者、73例T2DM患者和40例健康受试者的血清8-OHdG水平，发现糖尿病心肌病患者血清8-OHdG水平明显高于糖尿病组和对照组，而且糖尿病心肌病患者心功能不全程度越重, 氧化应激水平越高，8-OHdG水平越高，左心室中度和重度扩大组患者血清8-OHdG水平显著高于轻度扩大组，左心室收缩功能不全+舒张功能不全组患者血清8-OHdG水平明显高于单纯舒张功能不全组[7]。

1.2.4 糖尿病冠状动脉性疾病Nishikawa等[8]研究发现，8-OHdG尿排泄量的增加与冠状动脉性心脏病风险有显著上升相关。35名伴有高血压的T2DM患者在接受12个月的血管紧张素II受体阻断剂（angiotensin II receptor blockers，ARB） 治疗后，8-OHdG排泄量明显降低[16]。在匹伐他汀治疗12个月后，45名伴有高LDL胆固醇的T2MD患者8-OHdG尿排泄量明显降低[17]。

2 8-OHdG与癌症的诊断

众所周知，氧化应激在致癌作用中扮演着重要角色。未能及时修复的氧化损伤会显著增加体内突变率。越来越多的证据表明，恶性细胞有着高水平的氧化损伤，同时也在各种肿瘤中检测到高水平的8-OHdG。近年来，在分子流行病学研究中，将氧化应激机制与8-OHdG作为多种疾病（尤其是癌症）的危险因子相结合的应用研究有所增加[18]。针对不同类别的癌症患者，检测患者组织、体液中的8-OHdG水平，或作证预测癌症患病风险、预后、协助临床治疗。

2.1 肺癌

王云南等[19]发现8-OHdG主要分布在肺癌的癌灶部位，癌旁肺组织中的量明显减少，肺癌组织、癌旁肺组织、肺良性病变和正常肺组织8-OHdG的阳性率依次降低。表明氧化损伤与细胞癌变在组织和细胞定位上具有一致性。另有结果显示，尿液中8-OHdG含量取决于疾病的严重程度，尿液中8-OHdG含量由低到高依次为：转移性肺癌、肺癌初期（原发性肺癌）、良性肺部疾病患者。肺癌患者中II～IV期肺癌患者尿液中8-OHdG含量低于I期肺癌患者。Sheng等[20]的研究还发现，非小细胞肺癌患者肿瘤组织中8-OHdG水平较低的病人存活时间较长，8-OHdG水平高的病人的死亡的危险增加了3倍以上。Erhola等[21]证实，化疗后非小细胞肺癌患者中无响应或疾病恶化者尿液中8-OHdG/肌酐水平表达的DNA氧化损伤增加显著，完全缓解或部分缓解者下降。在放疗过程中，非小细胞肺癌患者8-OHdG/肌酐上升，放疗结束后2个月，8-OHdG/肌酐恢复到放疗前的基线水平。8-OHdG排放水平呈先增加后下降的趋势。

2.2 卵巢癌

两个独立的研究小组[22-23]均发现上皮卵巢癌患者组织和血清中高水平的8-OHdG都可预示患者的低存活率，其中血清中8-OHdG浓度与I至II期患者死亡率关联密切，这一结果与同时进行的传统不良预后和血清组织学研究结果一致。Marjo等[24]还发现，良性和临界性卵巢肿瘤氧化应激水平相似，但其水平远低于恶性肿瘤。

2.3 乳腺癌

Kuo等研究表明，乳腺癌患者尿8-OHdG水平为正常受试者的2.5倍[25]。在Sova等[26]的研究中，血清和肿瘤组织中8-OHdG水平高度一致，且它们的水平与乳腺癌恶性程度密切相关，尤其是乳腺导管癌。另有研究发现，8-OHdG免疫显色呈阴性可作为乳腺癌病人死亡率的预后指标，而8-OHdG血清水平负相关于乳腺癌的淋巴结转移。

2.4 其他癌症

8-OHdG水平与其它类型癌症的发生发展也有明确的相关性。例如：Chang等[27]发现，结肠直肠癌患者血清中8-OHdG水平为对照组的4倍。Sato等[28]发现，血浆中8-OHdG水平明显上升，可暗示有结肠直肠腺瘤和早期癌症的患病风险。在对表皮黑色素瘤的研究中，Murtas等[29]使用免疫组化法研究得出，核内8-OHdG表达呈阳性的癌症患者死亡风险大大升高，核内8-OHdG与其他传统标志物一起可以作为早期表皮黑色素瘤的预后因素。食道上皮细胞癌患者尿液中8-OHdG水平显著高于对照组[30]。

3 8-OHdG与心血管疾病的诊断

ROS可以通过激活细胞分裂素活化蛋白酶和转录因子，来刺激心肌生长、介质改造及细胞功能异常，从而对心脏结构及功能产生直接影响[31]。氧化损伤涉及到心血管疾病的发病和发展，大量文献表明，8-OHdG可以单独或与其他生理指标一同反映心血管疾病病程、发病率和死亡率。例如：冠心病[32]、原发性高血压[33]、慢性心力衰竭患者[34-35]血清中8-OHdG浓度高于健康受试者，其中，伴随左心室肥大的高血压患者即便接受了药物治疗，其尿8-OHdG水平仍然明显较高于原发性高血压[33]。患者体液中8-OHdG水平增加，其冠状动脉狭窄程度增加[32]，心力衰竭病情加剧[34-35]。另有研究证实，8-OHdG水平与许多心脏功能参数有显著关联，其中与左心室射血分数关系尤为密切，提示8-OHdG水平其可能为左心室机能异常及心室再造的临床标志物。这种关联与脑钠素（brain natriuretic peptide，BNP）一致，而BNP是目前评价慢性心衰的黄金标准[35]。因此，体液中8-OHdG水平可以有效地反映症候和心脏机能，进而对慢性心衰严重性进行临床诊断[35-37]。

4 8-OHdG的测定

目前常用定量方法测定8-OHdG，主要通过2种主要的分析途径：一种是酶联免疫吸附法 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[26，28]。ELISA因样品处理过程简便，但ELISA专属性较差，如尿液中的尿素与8-OHdG就存在交叉反应[38]，导致检测值比真实值偏高，故得到数据需矫正，或选择专属性更强的检测方法。

另一种为基于色谱联用技术的检测方法，如GC-MS[39]、HPLC-ECD[40]、LC-MS/MS[41-43]、CE-ECD[39，44]等。此类检测方法的专属性明显优于ELISA法，但样品需经过DNA提取水解、SPE纯化，处理步骤较为复杂。

近年来LC-MS/MS及相关技术，如在线样品处理技术与同位素稀释的快速发展极大地提高了LC-MS/MS分析的灵敏度和可靠性[43-44]。因此，近年来LC-MS/MS技术逐渐成为定量测定体液中8-OHdG水平的主流解决方案。

5 小 结

8-OHdG能够衡量细胞内氧化应激水平，反映在病理状态下细胞的内环境，且经代谢后在循环系统内稳定存在，体液及相关组织器官的8-OHdG水平可以为评价发病风险、疾病病程及治疗效果提供更加直观、有效的信息。因此，8-OHdG可能成为一种极有前途的生物标志物并最终用于糖尿病、癌症、心血管疾病等氧化应激相关疾病的病情诊断及治疗评价。目前8-OHdG的临床应用尚在研究探索阶段，受试者数量有限，缺乏合理的临床设计，如受试者数量有限、未设计安慰剂对照等，且分析方法多采用专属性不强的ELISA法测定，因此在具体应用时应谨慎分析对待这些研究结果，在未来的研究中需要采用更加专属的测定方法，如LC-MS法，同时进行长期大规模研究并设置对照组或设计随机临床试验来进一步确认8-OHdG与各类具体疾病的发病、病程发展、预后之间的定量关系。

总之，8-OHdG作为生物标志物对氧化应激相关疾病的诊断，相比于目前的方法在许多方面存在明显优势，例如利用基于LC-MS技术定量地考察病患体内8-OHdG水平及动态变化过程，而传统免疫学方法仅能进行半定量或定性的判断；并且测定8-OHdG所需样品采集无创（如尿液中8-OHdG的测定），可大大提高患者顺应性，便于实时监测和个体化治疗。当然，8-OHdG的水平差异变化也可以作为现有诊断方法的补充，以期进一步提高临床诊断的准确性和可靠性。

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