洛伐他汀自组装前体脂质体的制备及其理化性质的研究

孙川棣，刘建平

中国药科大学药剂研究所，南京 210009

他汀类（statins）药物是目前国内外研究最多也最具前途的降血脂药物。目前临床较常用的他汀类药物有：洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀等。其中辛伐他汀（simvastatin）由美国默克公司开发，1991年获美国食品药品监督管理局（FDA）批准[1]。普伐他汀（pravastatin）由日本三共株式会社研究成功后于1989年率先在日本上市。洛伐他汀（lovastatin）是第一个获美国FDA批准上市的他汀类药物,它主要用于治疗原发性高胆固醇血症和以高胆固醇异常为主的高脂血症，还可防治冠状动脉粥样硬化、延缓硬化进程，并减少梗塞病的发生。其独特的疗效，被誉为治疗心血管系统疾病的里程碑，深受广大患者的欢迎[2]。

目前临床上使用的洛伐他汀以片剂和胶囊剂等口服制剂为主，如Merck公司的系列产品[3-5]Lovalip®、Mevacor®、Mevinacor®、Mevlor®以及 Sidus公司的Sivlor®。国内也研制了洛伐他汀的普通片，主要品种有罗华宁®、美降脂®、美降之®等，其他上市的还有滴丸、缓释片、胶囊[6]。但由于其水溶性差，口服吸收率仅为31%，存在肝首过效应[7]，体内消除半衰期仅为3 h左右，属于短半衰期药物，口服生物利用度低，有胃肠道不适、腹泻、胀气等常见不良反应[8]，这些给预防用药的患者和大多数慢性心血管病患者带来了诸多不便。

脂质体作为新型的载体给药系统，具有生物膜特性和药物传输能力，将难溶性药物包裹在脂质双分子层中，使其具有较强的两亲性,可以显著提高药物的口服跨膜吸收率及体内生物利用度[9-10]。本研究以洛伐他汀为模型药物，制成洛伐他汀自组装前体脂质体（self-assemble proliposomes），克服了普通脂质体在贮存期间易发生聚集、融合及药物渗漏等稳定性问题；同时，洛伐他汀自组装前体脂质体制备工艺简单，易于扩大化生产，省去了固体型前体脂质体除去有机溶剂的步骤，解决了其水合过程中存在的水合速度较慢、分散不均匀等问题。目前尚未见洛伐他汀脂质体口服制剂报道，此研究为提高洛伐他汀的生物利用度，开发口服洛伐他汀脂质体制剂，使其更好地发挥临床疗效奠定了基础。

1 试剂与仪器

洛伐他汀（扬子江药业惠赠）；洛伐他汀对照品（中国药品生物制品鉴定所，批号：100600-200502）；大豆磷脂(上海太伟药业有限公司，批号：100819)；胆固醇（Sigma 公司，批号：MKBD9096V）；去氧胆酸钠 （国药集团化学试剂有限公司,批号：F20100607）；Sephadex G-50（Pharmacia 进口分装）。PEG400（西陇化工股份有限公司，CP）；无水乙醇（南京化学试剂有限公司，分析纯）。

UV-2000紫外可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）；日立H-7650透射电镜（日本日立公司）；Zetasizer 3000HSA粒径测定仪 （英国Malvern公司）。

2 方法与结果

2.1 洛伐他汀自组装前体脂质体的制备

大豆磷脂为膜材,无水乙醇、PEG-400为分散介质，将处方量洛伐他汀直接溶解于含有大豆磷脂、PEG-400的无水乙醇溶液中，再加入适量修饰剂A（即伯洛沙姆）、胆固醇、去氧胆酸钠，溶解制成前体脂质体澄明溶液后，以0.22 μm微孔滤膜过滤，即制成洛伐他汀自组装前体脂质体。取洛伐他汀前体脂质体少量，加入水合介质振摇得白色混悬液，即得到洛伐他汀脂质体。

2.2 洛伐他汀的分光光度分析方法

精密称取干燥至恒重的洛伐他汀适量于量瓶中，经无水乙醇定容后稀释到质量浓度为100 μg·mL-1的储备液。精密吸取储备液适量至10 mL量瓶中，分别用无水乙醇稀释至刻度，摇匀得浓度为2、4、8、12、16 μg·mL-1的洛伐他汀溶液，以无水乙醇空白作对照，分别于238 nm处测定吸收度值，以浓度（C）对吸收度值（A）线性回归得标准方程。洛伐他汀含量的线性回归方程为：C=16.01A+0.1726，r=0.9999，线性范围：4～16 μg·mL-1。 高、中、低 3 个浓度的平均回收率分别为99.92%、99.54%及99.59%,日内及日间精密度RSD均＜2%,均符合要求。因在238 nm处辅料对药物测定有干扰，每次测定需制备空白脂质体用无水乙醇定容并测定吸收值，从总吸收值中扣除辅料的吸收值[11]。

2.3 正交实验处方筛选

采用正交试验筛选前体脂质体的处方，选择药物∶磷脂（A，1∶20、1∶18、1∶15）、磷脂∶修饰剂 A（B，3∶1、2.5∶1、2∶1）、 磷脂∶胆固醇 （C，20∶1、10∶1、5∶1）3 个因素，每个因素3个水平，以水合后的包封率为指标，用L9（34）正交试验表研究辅料用量对前体脂质体物理特性的影响，筛选和优化前体脂质体的处方。实验结果表明，各因素主次顺序为：C＞B＞A，最优方案是 A2B1C1。故最优处方为：药物∶磷脂为 1∶18，磷脂∶修饰剂 A 为 3∶1，磷脂∶胆固醇为 20∶1。

2.4 脂质体的质量评价

2.4.1 脂质体形态取洛伐他汀前体脂质体分别用蒸馏水和人工胃液水合，所得脂质体混悬液滴至专用覆盖碳膜铜网上，静置5 min，用2.0%磷钨酸钠负染液染色，室温自然晾干，然后用日立H-7650透射电镜观察。结果如图1所示，A图和B图中都可见脂质体为圆球或近圆球形，且具有明显的指纹特征，说明洛伐他汀前体脂质体在水中和人工胃液中都能成功自组装成为脂质体。

图1 洛伐他汀脂质体透射电镜图

2.4.2 粒径和Zeta电位取水合后脂质体混悬液用蒸馏水适当稀释，用Zetasizer 3000HS激光粒度仪测定粒径和Zeta电位。结果表明，洛伐他汀脂质体的平均粒径为 （327.4±29.6）nm，多分散系数为0.447±0.102，Zeta电位为-（22.40±1.5）mV， 表明脂质体粒子表面荷负电，在一定程度上阻止了粒子聚结，从而保证了脂质体混悬液的物理稳定性。

2.4.3 微柱离心法测定洛伐他汀脂质体的包封率

2.4.3.1 洗脱曲线 采用微柱离心法分离脂质体与游离药物，取5 mL塑料注射器，去芯，底部塞入脱脂棉，装入预先用蒸馏水浸泡的葡聚糖凝胶，柱高约 5 cm，1000 r·min-1离心 2 min除去过量的蒸馏水，得到葡聚糖凝胶微柱。

精密吸取水合的洛伐他汀脂质体0.4 mL，缓缓加于柱顶部，1000 r·min-1离心2 min收集滤液，再于柱顶部加入相同体积的蒸馏水，相同条件下离心，重复上述操作，分别收集每次离心所得的滤液，用无水乙醇定容至10 mL，测定吸收度后计算药物浓度，绘制洗脱曲线，结果见图2。由图2可知，脂质体在前2 mL洗脱完毕，游离药物后被洗脱下来，脂质体和游离药物分离良好。

图2 洛伐他汀脂质体包封率测定的洗脱曲线

2.4.3.2 包封率测定 按“2.4.3.1”项下制备葡聚糖凝胶微柱，取水合的洛伐他汀脂质体0.4 mL缓慢滴加到柱床上，将微柱放入干净的离心管中，1000 r·min-1离心2 min，连续洗脱3次，合并所收集的滤液，无水乙醇定容后测定吸收度，计算得到已包封药物浓度 （C1）；另取水合后的洛伐他汀脂质体0.4 mL，加入无水乙醇定容，检测总药物浓度（C0）；包封率（E）=C1/C0×100%。3批样品中洛伐他汀的平均包封率为95.4%±6.7%。

2.4.4 洛伐他汀脂质体的自组装速度的测定类脂在水性介质中所形成胶体溶液的分散程度可通过测定其浊度（τ）的变化来评价，当类脂在水性介质中分散形成均一体系时，体系的浊度几乎达到坪值，不再发生明显的变化。由于胶体溶液的浊度（τ）与其吸光度（A）呈正相关[12]，因此可通过测定洛伐他汀前体脂质体自组装过程中吸收度的变化来评价其自组装的速度和程度。具体方法为：使用人工胃液配对，在样品池中加入3 mL人工胃液，用微量进样针在液面下快速注入前体脂质体，反复振摇，在600 nm处快速测定吸收度，每份样品测定3次，最高点时间和稳定时间的吸收度取平均值，以此考察洛伐他汀前体脂质体在水合介质中的自组装速度，结果见图3。从图3可见，吸收度在60 s左右不再变化，说明洛伐他汀自组装前体脂质体在60 s内形成脂质体，并达到分散平衡。

图3 洛伐他汀前体脂质体自组装速度

2.4.5 渗漏稳定性分别取洛伐他汀前体脂质体于不同量人工胃液中水合形成不同稀释倍数的洛伐他汀脂质体溶液（50倍、100倍），并将此脂质体于 4℃放置 0、2、4、6、8、12 h 后测定包封率，以放置后的药物包封率与初制备时的包封率相比，考察脂质体渗漏率。结果见表1。由表1可见，与0 h相比，洛伐他汀脂质体在4℃放置12 h后，包封率变化不大，说明药物渗漏较少，脂质体较稳定。

表1 洛伐他汀脂质体的渗漏稳定性

2.4.6 粒径稳定性取一定量的洛伐他汀自组装前体脂质体注入人工胃液中形成自组装洛伐他汀脂质体，于 0、1、2、3、4、5、6、8、12 h 测定粒径大小，以不同时间点的粒径大小对时间作图，评价洛伐他汀脂质体在水合介质中的粒径稳定性。由图4可见，不同时间水合后，脂质体粒子粒径变化不大，预示前体脂质体进入体内后同水分逐渐接触的过程中，脂质体粒子不会发生聚结、融合。

图4 洛伐他汀脂质体的粒径稳定性

3 讨 论

前体脂质体在一定程度上克服了传统脂质体易聚集、融合及药物渗漏等不稳定问题，但在制备固体型前体脂质体过程中，因其工艺复杂，成本高，难以用于临床，且固体型前体脂质体水合过程也存在水合速度较慢、局部溶解不完全、分散不均匀等问题，从而导致药物包封率和粒径等主要质量指标不易有效控制，故难以满足临床使用要求，至今尚无该类制剂上市。本文采用一种新型前体脂质体制备方法，此法简便易行，在水合过程中不必采用匀化技术或机械，即可快速自组装成为包封率高的含药脂质体，同时避免了以往固体型前体脂质体制备中有机溶媒的去除过程。本法制备的自组装前体脂质体在贮存过程中为无水状态的澄明液体，是一种动力学稳定体系,有效解决了脂质体的稳定性问题，这为脂质体真正走向市场开拓了新途径。

采用本文的前体脂质体制备方法得到的洛伐他汀前体脂质体可快速自组装形成含药脂质体，且脂质体包封率较高。渗漏和粒径稳定性实验表明脂质体具有良好稳定性。

本文将洛伐他汀制成新型前体脂质体，并初步考察了制备洛伐他汀前体脂质体的可行性。洛伐他汀前体脂质体的体内动力学特征、分布、代谢等情况，仍需进一步考察。

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