支气管哮喘与HLA-DPB1基因相关性的研究

陈丽萍，薛红，李景姝，窦林松，李彤

(1．沈阳医学院沈洲医院呼吸内科，辽宁 沈阳 110002；2．沈阳市胸科医院呼吸内科)

支气管哮喘(简称哮喘)其发病机制复杂，现已发现不同的人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)等位基因在哮喘的发病中起抑制作用或为哮喘的易感基因。HLA-Ⅱ类基因在复合体中位于近着丝点一端，命名为HLA-D，其结构最为复杂，至少分为DP、DQ和DR三个亚区。本实验采用序列特异性引物聚合酶链反应(polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP)技术检测辽宁沈阳地区汉族人HLA-DPB1等位基因频率，从免疫遗传学角度探讨支气管哮喘与HLA-DPB基因相关性，现报道如下。

1 资料和方法

1.1 研究对象及分组 2009年6月至2011年5月收治于我院呼吸内科的支气管哮喘患者100例，均为轻、中度哮喘患者[1]，男46例，女54例，年龄(50.5±6.2)岁，所有受试者均无茶碱、糖皮质激素治疗史，静脉抽血，酶联免疫法检测血总IgE明显增高。100例健康体检对照者，男48例，女52例，年龄(48.6±5.7)岁，所有受试者均无吸烟史，近4周内无上呼吸道感染史。各组年龄、性别构成比差异无统计学意义(P>0.05)。所有入选者均为汉族，长期生活在沈阳地区(3代或以上)，并除外免疫系统疾病等HLA相关疾病及家族史。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 Tris、硼酸、EDTA-Na2、SDS(上海试剂厂)；蛋白酶K、DL 1 000 bp Marker、Taq DNA聚合酶、10×Buffer、dNTP (TaKaRa公司)；琼脂糖、genefinder(华美生物工程公司)。

1.2.2 主要仪器 DNA扩增仪(Biometra，T-gradient)；电泳仪(Pharmacia，ESP 500/400)；电泳槽(北京六一仪器厂，DYY-III33A)； 紫外分光光度计(Unico，2800)；高速台式离心机(上海医用分析仪器厂，TGL-16G)；低温冰箱(新飞，BC/BD-625)；恒温水浴槽(北京六一仪器厂，SY-1220)；紫外凝胶成像分析系统(White/Ultraviolet Trasilliominator，OLYMPIA)。

1.2.3 外周血基因组DNA提取 抽取外周静脉血0.5 ml，2%EDTA 100 nl抗凝，传统酚-氯仿法提取基因组DNA。用紫外分光光度计测定DNA含量和纯度，根据A260/A280值计算DNA的含量和纯度(吸光度A旧称光密度OD)。

1.2.4 引物合成 根据文献合成PCR扩增引物。

1.2.5 PCR扩增 PCR反应体系：反应总体积20 μl，基因组DNA(浓度10～40 ng/μl)2 μl ，Taq酶0.5 U，dNTPs(200 pmol/μl)1.5 μl，10×PCR Buffer 2 μl，SSP引物，内对照引物(浓度1 pmol/μl)各2 μl，无菌去离子水补至20 μl。

PCR反应条件：预变性94 ℃ 5 min；变性94 ℃ 1 min；退火54 ℃ 40 s；延伸72 ℃ 60 s；35个循环，终末延伸72 ℃ 10 min。

1.2.6 PCR产物检测 PCR扩增产物加样至含有genefinder核酸染料的1%琼脂糖凝胶，用50 bp Ladder核酸分子Marker进行对照，在1×TBE缓冲液中进行电泳，电压110 V，时间45 min。电泳后取出琼脂糖凝胶，在紫外凝胶成像分析系统上分析。

1.3 统计学处理 统计分析应用SPSS13.0统计软件，基因频率的计算采用直接计数法，基因频率=阳性基因数/样本数×2，各组间等位基因分布比较选用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

1.4 质量控制 假阴性和假阳性控制：每次PCR反应的DNA基因型别的判定，必须在有清晰的阳性对照(内对照)扩增产物带和阴性对照孔无任何带型出现的前提下进行。

2 结果

支气管哮喘者HLA-DPB1*0201等位基因频率，PCR扩增结果在紫外凝胶成像分析系统上显示，PCR产物经电泳后，在DNA分子Marker 400 bp与450 bp条带之间，哮喘组和对照组均可见到内对照引物的PCR产物带(429 bp)；在DNA分子Marker 300 bp与350 bp条带之间，对照组中有25个样品出现目的基因的PCR产物带(327 bp)，哮喘组中出现目的基因有4个样品PCR产物带。经卡方检验示两组比较差异有显著性(P<0.05)。见表1。

表1 HLA-DPB1 * 0201等位基因出现频率

3 讨论

HLA分子是位于人类第6对染色体短臂(6P)上3 600 kb的一个狭窄区域内，其多态性最为复杂，其中HLA-Ⅱ类基因靠近着丝点，全长1 000 kb，包括DP、DQ、DR位点。多数学者认为，哮喘是一种多基因病。国际HLA组及家族基础的研究证实了HLA-Ⅱ类基因与尘螨诱导的哮喘间的关系[2]。HLA-Ⅱ类基因是一组免疫应答基因，具有高度多态性，其基因多态性决定HLA抗原分子的多态性，也就决定了HLA系统参与的免疫反应多样性和复杂性。

由于HLA-Ⅱ类基因表型的多态性，研究对象的种族差异和实验方法等原因，世界各地的理论报道不尽相同。国内学者高金明等[3]对北京地区哮喘患者的基因检测发现HLA-DQA1*0104和HLA-DQB1*201基因与我国哮喘患者易感性相关。而HLA-DQA1*0301基因和HLA-DQB1*0301基因则与哮喘的抗性有关。郭雪君等[4]对上海地区哮喘患者的基因检测发现HLA-DQB1*0303和HLA-DQB1*0601等位基因频率较正常对照组显著升高，HLA-DQB1*0201等位基因频率在对屋尘螨抗原特异性IgE反应哮喘家族成员中有显著高频表达。2009年韩国Choi等[5]研究发现HLA DRB1*1501是甲苯二异氰酸烟盐获得性哮喘中的致病基因。Chaporal等[6]研究发现有关易感基因的患者，在接触过敏原的环境中，有着更高的敏感性，HLA-DQ，DR与哮喘的免疫应答密切相关。Kalpaklioglu等[7]分析了蟑螂过敏患者与HLA-DRB1*0701等位基因频率在过敏组明显升高。

本研究发现HLA-DPB1* 0201目的基因在哮喘患组的出现频率低于健康对照组，HLA-DPB1* 0201可能为一种免疫抑制基因，可减少哮喘的发生，HLA-DPB1等位基因可能通过抑制机体对抗原的应答而降低哮喘的发病率。我们研究结果与以往报道的有所不同，可能由于本次实验研究仅以散发哮喘患者而非哮喘家系作为研究对象。可能与地域的分布和基因的高度多态性有关。从国内外一些学者和我们的实验结果比较可以看出，由于研究对象的遗传背景存在很大差异及所选区域病例有所不同，故实验结果可能不太一致；同时支气管哮喘的临床表现复杂，为分析哮喘的遗传特点带来一定的困难。本实验从HLA-DPB1*0201这一角度探讨了支气管哮喘的遗传机制，今后还需进一步扩大样本量，结合家系调查，以家系为基础的群体分析。本研究为哮喘发病机制的研究提供理论基础，同时保护性基因的发现也为下一步的研究提供了科学依据。

参考文献：

[1]中华医学会呼吸病分会哮喘组．支气管哮喘防治指南(支气管哮喘的定义、诊断、治疗及教育和管理方案) [J]．中华结核病呼吸杂志，2008，31(3)：177-185．

[2]Blumental MN，Caraballo L，Cookson W，et al． HLA-linked susceptibility to house dust mite-induced asthma[J]．J Allergy Clin Immunol，1997，99(1Pt2)：s338．

[3]高金明，林耀广，邱长春，等． 中国北方汉族人群人类白细胞抗原-DQA1 ，HLA-DQB1基因多态性与支气管哮喘遗传易感性的关系[J]．中华医学杂志，2002，82(6)：379-383．

[4]郭雪君，倪培华，李莉，等．HLA-DQ等位基因与哮喘相关性研究[J ]．中华结核和呼吸杂志，2001，24(3)：139-141．

[5]Choi JH，Lee KW． The HLA DRBI*1501-DQB1* 0602-DPB1*0501 haplotype is a risk factor for toluene diisocyanate-induced occupational asthma[J]． Int Arch Allergy Immunol，2009，150(2)： 156-163．

[6]Chapoval SP，David CS． Identification of antigenic epitopes on human allergens： studies with HLA transgenic mice[J]． Environ Health Perspect，2003，111(2)： 245-250.

[7]Kalpaklioglu AF，Turan M． Possible association between cockroach allergy and HLA class Ⅱantigens[J ]． Ann Allergy Asthma Immunol，2002，89 (2)： 155-158．