泄浊解毒方对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织TLR4/NF-κB信号通路的影响

陈文刚，陈建权，刘建平，荣英蕊，郎晓猛

（1.河北省玉田县医院内二科，河北玉田 064100；2.河北省中医院消化内科，河北石家庄 050011；3.河北医科大学研究生学院，河北石家庄 050011）

泄浊解毒方对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织TLR4/NF-κB信号通路的影响

陈文刚1，陈建权1，刘建平2*，荣英蕊3，郎晓猛3

（1.河北省玉田县医院内二科，河北玉田 064100；2.河北省中医院消化内科，河北石家庄 050011；3.河北医科大学研究生学院，河北石家庄 050011）

目的观察泄浊解毒方对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织Toll样受体4（toll like receptor 4，TLR4）/核因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）信号通路的影响。方法2，4，6-三硝基苯磺酸/乙醇混合溶液灌肠复制溃疡性结肠炎大鼠模型。设正常组、模型组、柳氮磺胺吡啶组、泄浊解毒方小剂量组、泄浊解毒方大剂量组；观察大鼠结肠组织TLR4及NF-κB表达。结果与模型组、柳氮磺胺吡啶组、泄浊解毒方小剂量组相比，泄浊解毒方大剂量组TLR4mRNA及NF-κB的表达均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论泄浊解毒方可明显减少溃疡性结肠炎大鼠结肠组织TLR4及NF-κB表达，这可能是其对溃疡性结肠炎治疗作用的机制之一。

结肠炎，溃疡性；泄浊解毒方；大鼠

溃疡性结肠炎（ulcerativecolitis，UC）是一种原因不明的慢性非特异性炎症性肠病。多认为UC发病与免疫反应的异常有关，Toll样受体4（toll like receptor 4，TLR4）/核因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）信号通路在免疫调节中发挥着极其重要的作用［1］。泄浊解毒方为笔者课题组临床实践中筛选出的治疗溃疡性结肠炎的有效方剂，为进一步探讨泄浊解毒方免疫调节作用机制，我们复制了2，4，6-三硝基苯磺酸/乙醇大鼠溃疡性结肠炎模型，并在此模型上观察泄浊解毒方对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织TLR4/NF-κB信号通路的影响并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物：健康成年雄性SD大鼠45只，体质量200～220g，由河北医科大学实验动物中心提供；动物等级，一级；合格证712101。

1.2 药品与试剂：传统泄浊解毒方（鱼腥草20g、败酱草18g、红藤15g、葛根12g、车前子12g、黄连6g、黄芩6g、薏苡仁12g、木香3g等）为中药复方，每毫升原液含生药2.0g（成人1.45g·d-1·kg-1），由河北省中医院制剂室提供。泄浊解毒方小剂量和大剂量（5.0g/kg、20.0g/kg）分别相当于临床成人日用量的3.5和14倍。柳氮磺胺吡啶（salazosulfamide，SASP，上海三维制药有限公司生产，批号200609C15）；2，4，6-三硝基苯磺酸、焦碳酸二乙酯（购自Sigma公司）；RT Reagents、PCR Reagents、DNA Marker（购自TaKaRa公司）；Trizol（购自nvitrogen公司）；一抗TLR4、SP免疫组织化学染色试剂盒、DAB染色试剂盒，均为北京博奥森生物工程开发有限公司产品。均按试剂盒说明书进行检测。

1.3 模型制备：参考文献［1-2］应用2，4，6-三硝基苯磺酸/乙醇方法制备大鼠溃疡性结肠炎模型。实验前禁食24h，自由饮水，在乙醚麻醉下，用直径2mm的硅胶软管轻插至结肠8cm处，推入含30mg 2，4，6-三硝基苯磺酸的30%乙醇溶液，每只大鼠约0.5mL，捏紧肛门倒置10min即可。3d后，随机抽取5只模型组大鼠处死，取其结肠标本，病理检查确认有充血、水肿及典型溃疡形成等一系列病理变化即为造模成功。

1.4 分组及给药：按随机数字表法将40只大鼠随机分为5组。模型组8只，正常组8只，生理盐水2mL灌胃；泄浊解毒方小剂量组8只，5.0g/kg中药灌胃；泄浊解毒方大剂量组8只，20.0g/kg中药灌胃；柳氮磺胺吡啶组8只，0.50g/kg灌胃。共14d。

1.5 操作方法：造模后第14天，2%乌巴比妥钠腹腔麻醉（3mL/kg），解剖大鼠，沿矢状线正中切开，留取距肛门以上8cm处结肠标本，沿肠系膜缘剪开肠腔，用冷生理盐水冲洗肠内容物，迅速取部分结肠组织置于-70℃的液氮罐中，留做TLR4 mRNA，另取部分结肠组织，做免疫组织化学。

1.6 免疫组织化学染色（SP法）检测NF-κB表达：NF-κB p65阳性细胞主要为黏膜细胞、单核细胞及巨噬细胞，阳性细胞胞质和胞核内均有棕色颗粒，以胞核为主。采用图象分析技术，计数镜下单位面积（1mm×1mm）内的平均阳性细胞数量；根据参考文献［3］的评分标准法评估染色强度和阳性细胞数量分级，在40倍高倍镜下选取典型视野计数100个细胞，其中阳性细胞数作为NF-κB p65计数值，并以百分率表示。

1.7 结肠组织TLR4 mRNA的表达：取组织100mg左右，放入匀浆器内，加入适量的Trizol用匀浆器匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状，然后转移至新的离心管中，室温静置5min，4℃12 000r/min离心5min，小心吸取上清液于另一离心管，加入1/5体积的氯仿，震荡混匀后室温静置5min，4℃12 000r/min离心15min。转移上层水相到另一新离心管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀后室温静置10min，然后4℃12 000r/min离心10min，RNA形成白色的小团沉淀在离心管的底部和侧面，弃上清，加入75%乙醇1m L，4℃12 000r/min离心5min，尽量弃上清，漂洗2～3次RNA沉淀。最后，在无菌工作台中干燥RNA沉淀5～10min，加入焦碳酸二乙酯处理的50μL双蒸馏水，55℃～60℃温育10min使RNA充分溶解，取少许溶解的RNA，用TE Buffer稀释后于紫外分光光度计260和280nm处读取A值，A260/ A280=1.8～2.0间方可使用，总RNA浓度= A260×稀释倍数×0.04（g/L），用前调整为1g/L。

1.7.1 逆转录反应：取总RNA 2μg，加入逆转录反应体系（含AMV Buffer，dNTPs，Oligo dT Pri-mer，AMV，Rnase Inhibitor等）管中，并用DEPC处理水补足到50μL反应液体积，振荡混匀后短暂离心，加少许矿物油于PCR仪42℃30min（cDNA合成），99℃5min（逆转录酶失活），5℃5min。-20℃保存备用。1.7.2 PCR反应

1.7.2.1 PCR扩增引物：引物由北京塞百盛基因技术有限公司合成。Rat TLR4，退火温度为55℃，上游引物，5′-GTGGGTCAAGGACCAGAAAA-3′；下游引物，5′-GAAACTGCCATGTCTGAGCA-3′；扩增片段为526bp，Rat GAPDH，退火温度为52℃，上游引物，5′-CACCATGGAGAAGGCCGGGG-3′；下游引物，5′-GACGGACACATTGGGGGTAG-3′；扩增片段为408bp。

1.7.2.2 PCR反应体系：反应体系含Taq DNA聚合酶，dNTPs，上样染料，稳定剂，优化剂，反应缓冲液，逆转录反应产物，上下游引物等。振荡混匀后短暂离心，加少许矿物油于PCR仪扩增。

1.7.2.3 PCR反应条件：PCR扩增条件，94℃变性3min；94℃40s，各自的退火温度50s，72℃90s，30个循环；72℃延伸10min。

1.7.3 半定量分析：取每个标本的扩增产物6μL于1%含GV核酸染料的琼脂糖凝胶电泳，以DNA Marker（DL2000）作为标准分子量标记，电泳后于紫外透射仪观察，并用数码相机照相，输入微机应用法国VL公司BIO-PROFIF凝胶图象分析系统对目的电泳条带进行分析，以相应的内参电泳条带作为参照，结果以两者之积分吸光度的比值表示。

1.8 统计学方法：应用SPSS 17.0软件对数据进行统计学处理，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 泄浊解毒方对溃疡性结肠炎大鼠NF-κB p65的影响：与正常组相比，模型组NF-κB p65表达明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。与模型组相比，泄浊解毒方小剂量组、泄浊解毒方大剂量组、柳氮磺吡啶组NF-κB p65表达降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。与柳氮磺吡啶组相比，泄浊解毒方大剂量组NF-κB p65表达差异有统计学意义（P＜0.01），泄浊解毒方小剂量组表达差异无统计学意义（P＞0.05）。与泄浊解毒方小剂量组相比，泄浊解毒方大剂量组核因子-κB p65表达差异有统计学意义（P＜0.01）。

表1 大鼠结肠组织NF-κB的表达

2.2 泄浊解毒方对溃疡性结肠炎大鼠TLR4mRNA表达的影响：与正常组相比，模型组TLR4mRNA表达升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。与模型组相比，柳氮磺胺吡啶组、泄浊解毒方各组TLR4mRNA表达均降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。与柳氮磺胺吡啶组相比，泄浊解毒方大剂量组TLR4mRN的表达明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01），泄浊解毒方小剂量组表达差异无统计学意义（P＞0.05）。泄浊解毒方大剂量组TLR4蛋白水平的表达低于泄浊解毒方小剂量组，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 大鼠结肠组织TLR4m RNA表达

3 讨 论

NF-κB在免疫及炎症反应方面起着重要作用，有功能活性的NF-κB二聚体大都含p65亚单位，这样的二聚体具有显著的促炎活性［4］。TLR4是免疫系统中的跨膜受体，其介导的信号转导通路参与了UC的发生发展。TLR4通过Toll/IL-1R同源结构域（Toll/ILIR domain，TIR）与其下游信号转导分子，如髓样分化蛋白88（mye-loid differentiation factor88，MyD88）、白细胞介素-1相关蛋白激酶、肿瘤坏死因子受体活化因子6（tumornecrosis factorreceptor-associated factor 6，TRAF6）和β-转化生长因子激活的蛋白激酶（transforming growth factor-βactivatedkinase，TAK1）等相互作用，可促进下游NF-кB抑制蛋白激酶（inhibitorkinase of NF-кB，IKK）的2个亚型IKK-α和IKK-β的活化，最终使NF-κB转移到细胞核内并活化；二是通过进化保守信号媒介（evolutionarily con-TRIF），TRIF通过N末端结合结构域与TRAF6结合，随后激活IKK复合体，使NF-κB抑制蛋白活化，最终导致NF-κB释放入核，最终引起肠黏膜的炎症反应［5］。张弛等［6］以LPS刺激人脐静脉内皮细胞，TLR4表达上调同时NF-κB p65活性增加。程方平等［7］研究发现甘露消毒丹对温病湿热证大鼠肝巨噬细胞TLR4mRNA及NF-κB p65表达具有较好的干预调控作用，能中止炎症介质的转录，限制急性炎症反应。

泄浊解毒方由鱼腥草、车前子、红藤、败酱草、半夏、黄连、黄芩、葛根、生薏苡仁、木香组成，可明显升高结肠黏膜CD+8含量，降低结肠黏膜CD+4的水平，使CD+

4/CD+8的比值保持一定比例，具有良好的免疫调节作用。本研究结果表明，与空白组相比，模型组NF-κB p65及TLR4mRNA均表达明显升高，柳氮磺胺吡啶组及泄浊解毒方各组NF-κB p65及TLR4mRNA表达均降低，泄浊解毒方各组及柳氮磺胺吡啶组均可降低TLR4mRNA水平的表达及NF-κBp65蛋白水平的表达，尤其是泄浊解毒方大剂量组对TLR4mRNA及NF-κB p65的下调作用更为明显。因此，泄浊解毒方治疗溃疡性结肠炎可能是通过降低TLR4mRNA转录水平，使TLR4蛋白合成、表达减少，阻断TLR4/NF-κB信号通路的转导，减少促炎因子释放，抑制免疫系统的过度激活，纠正溃疡性结肠炎异常的免疫炎症反应而实现的。

［1］ 段征，汪维伟，姜蓉.两种溃疡性结肠炎大鼠模型的比较［J］.重庆医科大学学报，2008，33（1）：66-68，72.

［2］ HAGARHH，EL-MEDANY A，EL-ETER E，etal.Ameliorative effect of pyrrolidinedithiocarbamate on acetic acid-induced colitis in rats［J］.Eur JPharmacol，2007，554（1）：69-77.

［3］ 王皓，欧阳钦，胡仁伟.三硝基苯磺酸结肠炎动物模型的建立［J］.胃肠病学，2001，6（3）：7-10.

［4］ 荣英蕊，刘建平，陈建权.泄浊解毒方对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织大鼠NF-κBp65及ICAM-1表达的影响［J］.上海中医药杂志，2010，44（3）：63-68.

［5］ 周红光，陈海彬，吴勉华.从Toll样受体/核因子-κB信号通路探讨中药免疫调节作用机制［J］.中国中西医结合杂志，2010，30（8）：884-888.

［6］ 张弛，范建军.参附注射液对脐静脉内皮细胞Toll样受体4/ NF-κB途径的影响［J］.山西医药杂志，2006，35（9）：777-779.

［7］ 程方平，周洁，陈娟，等.甘露消毒丹对温病湿热证大鼠TLR4 mRNA、NF-κBp65表达的影响［J］.广州中医药大学学报，2007，26（4）：478-482.

（本文编辑：赵丽洁）

R574.62

B

1007-3205（2011）07-0803-03

2011-09-21；

2011-11-04

国家中医药管理局浊毒实验室资助项目（ZD200812-12）

陈文刚（1977-），男，河北玉田人，河北省玉田县医院主治医师，医学学士，从事消化内科疾病诊治研究。

*通讯作者。E-mail：Liujianping0311@yahoo.com.cn

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.07.021