浒苔硒多糖的制备及其活性研究

高玉杰，吕海涛

(青岛农业大学化学与药学院，山东 青岛 266109)

浒苔(Enteromorphaprolifera)是绿藻门、绿藻纲、石莼目、浒苔属的藻类植物，是一种重要的经济海藻，俗称海青菜、苔菜、苔条，为食用和药用藻类。《本草纲目》记载浒苔可“烧末吹鼻止衄血，汤浸捣敷手背肿痛”；《隐身居饮食谱》记载：“清胆，消瘰疬瘿瘤，泻胀，化痰，治水土不服”[1]。多糖是浒苔的主要活性物质之一，研究表明，浒苔多糖具有显著的降血糖和血胆固醇、抑制Ehrlich癌和皮肤癌的活性[2～4]。

硒是人体必需的微量元素，具有清除自由基、提高人体免疫能力、抗癌等作用[5，6]，另外，还可治疗克山病和大骨节病，并用于提高视力和防治肝坏死等疾病[7，8]。硒多糖具有硒与多糖的双重功效，有独特的生物活性，在抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等方面发挥着越来越重要的作用[9～12]，已成为研究的热点。

作者选取浒苔为原料提取浒苔多糖(EP)，并硒化得到浒苔硒多糖(Se-EP)，采用HPLC对其进行了单糖组成分析，并研究了浒苔硒多糖的活性，拟为开发新的抗衰老保健品等提供科学依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

浒苔采于青岛汇泉湾海域。

木瓜蛋白酶(65万U·g-1)，厦门星隆达化学试剂有限公司；1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH)，Sigma公司；乙腈(色谱纯)，天津津东天正精细化学试剂厂；硝酸、乙醇、硫酸、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、水杨酸、三氯乙酸、FeSO4、H2O2、铁氰化钾、三氯化铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等均为分析纯；实验用水为二次去离子水。

90-2型医用低速离心机、DF-Ⅱ型集热式恒温磁力搅拌器，江苏金坛恒丰仪器厂；AR2140型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；RE-52AA型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；SP-754型紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；TAS-986型原子吸收分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；LC-10ATvp型液相色谱仪(配有可变波长紫外可见检测器和浙江大学N2000色谱数据工作站)，岛津公司；Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，安捷伦科技公司。

1.2 浒苔硒多糖的制备

1.2.1 浒苔多糖的提取

取脱脂后的浒苔干粉用热水浸提，冷却，调pH值至5.5，加入质量分数为8％的木瓜蛋白酶脱蛋白后，经乙醇醇沉，得浒苔粗多糖(纯度为49.13％)。

1.2.2 浒苔硒多糖制备的单因素实验[13]

精确称取0.1 g浒苔粗多糖放入三口烧瓶中，加入10 mL 0.5％(体积分数)的硝酸溶液，加热搅拌使其全部溶解，得10 mg·mL-1的多糖溶液。按亚硒酸钠与多糖质量比(原料配比，下同)1∶1加入亚硒酸钠，加热搅拌，于70 ℃反应7 h，冷却，过滤，离心除去沉淀，溶液用流水透析，取少量透析液加入抗坏血酸检测亚硒酸钠的残留，无血红色时停止透析，真空冷冻干燥，即得浒苔硒多糖。

固定其它条件不变，依次改变原料配比(0.5∶1、1.0∶1、1.5∶1、2.0∶1)、反应时间(3 h、6 h、7 h、8 h、9 h)、反应温度(50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)、硝酸体积分数(0.3％、0.5％、1.0％、1.5％)，考察各因素对硒多糖中硒含量的影响。

1.2.3 浒苔硒多糖制备的正交实验

根据单因素实验结果，以硒多糖中硒含量为评价指标，设计L9(34)正交实验，以确定最佳合成工艺。正交实验的因素和水平见表1。

表1 浒苔硒多糖制备的正交实验的因素与水平

1.3 分析与测试

1.3.1 硒含量的测定

1.3.1.1 硒标准曲线的绘制

取亚硒酸钠0.1000 g置于100 mL烧杯中，加入浓硝酸10 mL。溶解后转移到100 mL容量瓶中，加超纯水稀释至刻度，摇匀，即得硒标准溶液。

精确量取硒标准溶液10 mL，用超纯水定容到1000 mL，得到浓度为10 μg·mL-1的母液。分别取母液0 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL，定容到10 mL，得Se浓度(μg·mL-1)分别为0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00的溶液，用原子吸收分光光度计测定吸光度值(测定波长为196.1 nm，光谱带宽为0.4 nm)。以亚硒酸钠溶液浓度(c)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线。拟合回归方程为：A=0.1638c+0.0059，相关系数为0.9962。

1.3.1.2 样品中硒含量的测定

取浒苔硒多糖样品，用超纯水溶解，定容至25 mL，测定吸光度值，根据回归方程计算其中硒的含量。

1.3.2 单糖组成分析[14，15]

用硫酸将浒苔硒多糖水解成单糖，将水解后的浒苔硒多糖样品液、混合单糖(D-甘露糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖和D-木糖5种单糖)标准液经1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生化后，0.45 μm微孔滤膜滤过，进样20 μL，HPLC分离检测。

色谱条件：色谱柱为Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；洗脱液为乙腈-pH值6.8的醋酸铵缓冲溶液(14∶86，体积比)；流速1 mL·min-1；检测波长245 nm。

1.3.3 光谱分析

1.3.3.1 紫外可见光谱

配制0.5 mg·mL-1的浒苔硒多糖溶液(溶液呈透明状)，以蒸馏水为空白，在190～900 nm范围内扫描紫外可见光谱。

1.3.3.2 红外光谱

取一定量的浒苔硒多糖固体粉末，KBr压片，在4000～400 cm-1范围内进行红外光谱扫描。

1.3.4 抗氧化活性的测定

1.3.4.1 对有机自由基DPPH的清除作用[16]

配制0.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、3.0 mg·mL-1、4.0 mg·mL-1的浒苔多糖溶液和浒苔硒多糖溶液。分别取2 mL，加入3 mL 0.016 mg·mL-1的DPPH·醇溶液(现用现配)，充分混合，避光反应30 min，在517 nm处测定各反应溶液的吸光度，实验设3个组：样品组(加入样品溶液)、对照组(不加样品溶液)、本底组(样品本身)。自由基清除率按下式计算：

式中：A0、A1、A2分别为对照组、样品组、本底组的吸光度值。

1.3.4.2 对羟自由基(·OH)的清除作用[17]

采用Fenton反应体系测定硒化前后浒苔多糖对·OH 的清除作用。配制1.0 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、3.0 mg·mL-1、4.0 mg·mL-1、5.0 mg·mL-1、6.0 mg·mL-1、7.0 mg·mL-1的浒苔多糖溶液和浒苔硒多糖溶液。分别取1 mL 9 mmol·L-1FeSO4溶液、1 mL 9 mmol·L-1水杨酸的乙醇溶液和1 mL 8.8 mmol·L-1H2O2，加入上述配制好的样品待测液各2 mL，混匀，37 ℃水浴反应30 min，以蒸馏水作空白，在510 nm处测定各反应溶液的吸光度。实验设3个组：样品组、对照组、本底组。自由基清除率计算方法同1.3.4.1。

1.3.4.3 还原能力的测定[18]

配制0 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、4.0 mg·mL-1、6.0 mg·mL-1、10.0 mg·mL-1的浒苔多糖溶液和浒苔硒多糖溶液。分别取1 mL，依次加入2.5 mL 0.2 mol·L-1的磷酸盐缓冲溶液(pH值 6.74)和2.5 mL 0.01 g·mL-1的铁氰化钾溶液，混合均匀后，于50 ℃水浴反应20 min，然后加入2.5 mL 0.1 g·mL-1的三氯乙酸溶液，混合均匀，离心10 min。移取2.5 mL上清液于另一试管中，加入2.5 mL蒸馏水和5 mL 0.001 g·mL-1三氯化铁溶液，混合均匀后，在700 nm处测定其吸光度。

2 结果与讨论

2.1 浒苔硒多糖合成工艺的优化

2.1.1 单因素实验结果与分析(图1)

图1 原料配比(a)、反应时间(b)、反应温度(c)和硝酸体积分数(d)对硒含量的影响

由图1可知，随着原料配比的增大，硒含量先上升后下降，在原料配比为1.0∶1时，硒含量最高；随着反应时间的延长，硒含量呈上升趋势，但反应时间超过8 h以后，硒含量升幅趋缓；随着反应温度的升高，硒含量先上升后下降，在反应温度为60 ℃时，硒含量最高，这是由于温度过高导致部分多糖发生降解，使硒含量降低；随着硝酸体积分数的增大，硒含量先上升后下降，在硝酸体积分数为0.5％时，硒含量最高。

2.1.2 正交实验结果与分析

正交实验的结果与分析见表2，方差分析见表3。

表2 正交实验结果与分析

由表2可知，各因素对浒苔硒多糖硒含量的影响大小依次为C>D>A>B，即反应温度>硝酸体积分数>原料配比>反应时间，最佳合成工艺为A2B3C2D2，即原料配比1.0∶1、反应时间8 h、反应温度60 ℃、硝酸体积分数0.5％。

表3 正交实验结果方差分析

由表3可以看出，4个实验因素对合成浒苔硒多糖的硒含量在统计学上均无显著影响。

2.1.3 验证实验

按上述最佳工艺条件合成浒苔硒多糖，平行测定3次，浒苔硒多糖的平均硒含量为512.3 μg·g-1(RSD=1.33％)，高于正交实验所测得的最高含量，表明所确定的最佳合成工艺条件可行。

2.2 单糖组成分析

经衍生化反应后，浒苔硒多糖样品、混合单糖标准品的高效液相色谱如图2所示。

1.D-甘露糖 2.L-鼠李糖 3.D-半乳糖醛酸 4.D-葡萄糖 5.D-木糖

由图2可以确定浒苔硒多糖由D-甘露糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖和D-木糖5种单糖组成。进一步由面积归一化法计算得到浒苔硒多糖中上述单糖物质的量比为0.01∶0.80∶0.12∶0.65∶0.09。

2.3 浒苔硒多糖的结构表征

2.3.1 紫外可见光谱

2.3.2 红外光谱(图3)

图3 浒苔多糖和浒苔硒多糖的红外光谱

由图3可知，硒化前后浒苔多糖的红外光谱相差不大，多糖的特征吸收峰未发生变化，不同的是浒苔硒多糖在786.78 cm-1附近出现了亚硒酸酯中Se=O双键的特征吸收峰，在453.46 cm-1附近出现了Se-C键的特征吸收峰。说明硒化后形成了新的化学键，即存在亚硒酸酯基团和Se-C键，而不是游离的亚硒酸根。这和紫外可见光谱分析结果一致，均说明硒与浒苔多糖得到了有效的结合。

2.4 浒苔硒多糖的抗氧化活性

2.4.1 对DPPH自由基的清除作用

DPPH自由基是一种稳定的以氮为中心的有机自由基，在517 nm处有最大吸收，其醇溶液呈紫色，当有抗氧化剂存在时，生成DPPH-H分子，颜色会变浅，吸光度值变小，而吸光度值的变化程度与清除DPPH自由基的程度呈定量关系，可以反映样品的抗氧化活性。浒苔多糖和浒苔硒多糖对DPPH自由基的清除效果如图4所示。

图4 浒苔多糖和浒苔硒多糖对DPPH自由基的清除效果

由图4可知，在较低浓度范围内，浒苔多糖和浒苔硒多糖对DPPH的清除能力都较弱；随着浓度的增大，DPPH清除率逐渐提高；当浓度超过3.0 mg·mL-1时，浒苔硒多糖清除DPPH能力明显强于浒苔多糖；在实验浓度范围内，浒苔硒多糖的DPPH清除率最高达51.6％，而浒苔多糖的DPPH清除率最高为40.13％。表明硒化后浒苔多糖对DPPH自由基的清除能力有所提高。另外，通过实验测得VC浓度为0.04 mg·mL-1时的DPPH清除率即可达52％，说明浒苔多糖和浒苔硒多糖对DPPH的清除能力不及VC。

2.4.2 对羟自由基(·OH)的清除作用

测定原理主要是FeSO4与H2O2反应产生·OH，以·OH氧化水杨酸所得产物的吸光度值表示·OH的多少，吸光度值越大，·OH越多。浒苔多糖和浒苔硒多糖对羟自由基(·OH)的清除效果如图5所示。

图5 浒苔多糖和浒苔硒多糖对羟自由基(·OH)的清除效果

由图5可知，浒苔多糖和浒苔硒多糖对羟自由基都有一定的清除能力，且呈现正相剂量关系；在实验浓度范围内，对羟自由基的清除率可达80％左右。另外，测得浒苔硒多糖的EC50为3.93 mg·mL-1、浒苔多糖的EC50为3.86 mg·mL-1，表明两者清除·OH的能力相差不大。

2.4.3 还原能力

样品可将铁氰化钾还原成亚铁氰化钾，亚铁氰化钾再与Fe3+作用生成亚铁氰化铁，在700 nm处检测的吸光度表示待测物质还原能力的大小，吸光度值越大，样品的还原能力越强。

浒苔多糖、浒苔硒多糖的还原能力如图6所示。

图6 浒苔多糖和浒苔硒多糖的还原能力

由图6可知，在实验浓度范围(1.0～10.0 mg·mL-1)内，浒苔硒多糖的吸光度明显高于浒苔多糖，说明浒苔硒多糖的还原能力优于浒苔多糖。另外，实验测得VC浓度为0.03 mg·mL-1时的吸光度值为0.253，说明浒苔多糖和浒苔硒多糖的还原能力低于VC的还原能力，但仍可能具有一定的抗氧化作用。Siddhuraju等[20]研究表明，样品的抗氧化活性在一定程度上与其还原能力相关。本实验中，浒苔硒多糖还原能力的提高可能与其中的硒元素有关。

3 结论

(1)利用自制的浒苔多糖和亚硒酸钠在硝酸催化下合成浒苔硒多糖的最佳条件为：亚硒酸钠与浒苔多糖的质量比1.0∶1、反应时间8 h、反应温度60 ℃、硝酸体积分数0.5％，在此条件下合成的浒苔硒多糖的硒含量为512.3 μg·g-1。其单糖组成为D-甘露糖∶L-鼠李糖∶D-半乳糖醛酸∶D-葡萄糖∶D-木糖=0.01∶0.80∶0.12∶0.65∶0.09(物质的量比)。

(2)紫外可见光谱、红外光谱分析表明，浒苔硒多糖中含有亚硒酸酯基团。

(3)浒苔硒多糖与浒苔多糖相比，清除有机自由基DPPH能力明显提高，还原能力也更好，但清除·OH的能力变化不大。

(4)将浒苔多糖与硒结合，提高了多糖产品的生物活性，可为研制新型的抗衰老保健品或药物提供理论参考，浒苔硒多糖的体内活性有待于进一步研究。

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