两个海洋环肽Galaxamide类似物的合成及抗肿瘤活性研究

陈 萌，曲 桐，徐石海

(暨南大学生命科学技术学院化学系，广东 广州 510632)

环肽类化合物是海洋生物次生代谢的产物，不仅具有多样及独特的化学结构，而且具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗炎和免疫抑制等多种生物活性。Galaxamide是从中国南海西沙群岛的海藻中分离得到的一个新型环五肽环(亮氨酰-N-甲基亮氨酰-亮氨酰-N-甲基亮氨酰-亮氨酰)，体外抗肿瘤实验表明该化合物对人体肾癌细胞(GRC-1)、人肝癌细胞(HepG2)有较好的细胞毒性(IC50分别为4.26 μg·mL-1、4.63 μg·mL-1)[1]。由于环肽的环状结构及其特殊的构象约束作用[2],与线性肽相比,稳定性更好,抗酶解能力更强。正是由于环肽独特的空间三维结构,其对于研究药物作用机理及开发新药都有着重要作用[3]。为了进一步探讨构效关系(SAR),作者在前人研究的基础上[4]采用经典的“3+2”全合成方法，同时改变原料亮氨酸构型和环肽的N-甲基的数量,设计合成了两个Galaxamide类似物(图1)，对其结构进行了表征，并研究了其体外抗肿瘤活性。Galaxamide类似物的合成路线见图2。

图1 Galaxamide类似物的结构式

图2 Galaxamide类似物的合成路线

1 实验

1.1 试剂与仪器

试剂均为市售AR或CP，未进一步纯化。

1200型高效液相色谱仪，Agilent公司;4000 Q TRAP型质谱仪，美国应用生物系统公司；INOVA 500 MHz型核磁共振仪，美国Varian公司；R-210BUCHI型旋转蒸发仪，瑞士Buchi公司；柱层析硅胶(200～300 目)，青岛海洋化工厂。

产物纯度由HPLC 检测分析。色谱条件：C18柱(4.6 mm×100 mm，220 nm)，流动相70％～100％ CH3OH/0.1％ TFA，流速1 mL·min-1，梯度洗脱。

1.2 合成

1.2.1 Boc-Leu(a1)的合成

向250 mL的圆底烧瓶中连续加入THF(56 mL)、H2O(42 mL)和NaOH(1 mol·L-1，42 mL)溶液，冰浴冷却下一次性加入L-Leu(2.62 g，20 mmol)，搅拌10 min使L-Leu溶解，然后一次性加入Boc2O(5.24 g，24 mmol)，冰浴下继续搅拌10 min，然后缓慢升至室温并调pH值为10～11，搅拌过夜。减压蒸除溶剂后用无水乙醚(80 mL×2)萃取，水相在冰浴下冷却，用盐酸酸化至 pH值为2～3，然后用乙酸乙酯(80 mL×3)萃取，合并有机相并用饱和食盐水(80 mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后蒸除溶剂，得到无色晶体 2.44 g，收率93％。MS(ESI)，m/z：232.2[M+H]+，249.2[M+NH4]+，254.3[M+Na]+。

1.2.2 Boc-Leu-N-Me-D-Leu-OBn(a2)的合成

1.2.3N-Me-Leu-OBn(a3)的合成

氮气保护、冰浴冷却下，向250 mL的圆底烧瓶中一次性加入a1(2.31 g，10 mmol)和THF(30 mL)，缓慢滴加碘甲烷(3.15 mL,15 mmol)，反应30 min后，缓慢加入60％氢化钠(50 mmol，1.2 g)。冰水浴下反应1 h后，室温下反应过夜。冰水浴下，滴加饱和氯化铵水溶液(10 mL)，再加饱和碳酸氢钠水溶液(20 mL)，减压蒸去THF。水溶液用石油醚洗涤(25 mL×2)后，冰水浴冷却下，滴加1 mol·L-1的盐酸调节水溶液pH值至 2～3，用乙酸乙酯提取(50 mL×4)。合并有机相，依次用5％的硫代硫酸钠(75 mL)、饱和食盐水(75 mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，浓缩，油泵干燥，得黄色油状物1.99 g，收率为87％。MS(ESI)，m/z：246.2[M+H]+，263.2[M+NH4]+，268.3[M+Na]+。

1.2.4 Boc-Leu-N-Me-Leu-OBn(a4)的合成

1.2.5 Boc-Leu-N-Me-Leu-Leu-OBn(a5)的合成

取a4(8 mmol，3.59 g)溶于30 mL CH2Cl2中，氮气保护下加入苯甲醚(16 mmol，1.7 mL)，冰浴下搅拌，缓慢滴加TFA(8 mL)，反应4 h后，减压蒸除溶剂，再加入CH2Cl2，减压蒸除，重复操作除去TFA，干燥，得到油状物直接用于下一步实验。

1.2.6 五肽Boc-Leu-N-Me-Leu-Leu-Leu-N-Me-D-Leu-OBn(a6)的合成

取a2(1.94 mmol，1.0 g)溶于20 mL CH2Cl2中，氮气保护下加入苯甲醚(3.98 mmol，0.4 mL)，冰浴下搅拌，缓慢滴加TFA(5 mL)，反应4 h后，减压蒸除溶剂，再加入CH2Cl2，减压蒸除，重复操作除去TFA，干燥，得到油状物直接用于下一步实验。

向50 mL二口圆底烧瓶中加入a5(2.3 mmol，1.0 g)的甲醇溶液(20 mL)，氮气保护下加入0.2 g 10％ Pd/C，封口，搅拌下通入氢气，室温下反应，TLC跟踪，3 h后，原料点消失，停止通入氢气，过滤，回收Pd/C，减压蒸除溶剂，干燥，得到无色固体直接用于下一步实验。

将上步无色固体溶于5 mL THF中，置于冰水浴中搅拌，氮气保护下连续加入DEPBT(2.9 mmol，0.87 g)、DIEA(2.9 mmol，0.5 mL)反应5 min后，滴加溶于CH2Cl2(5 mL)的上述油状物，自然升至室温，TLC跟踪反应。24 h后反应完成，减压蒸除溶剂。直接进行硅胶柱层析(淋洗剂V正己烷∶V丙酮=20∶1),得无色固体1.27 g，三步收率82％。MS(ESI),m/z：803.1[M+H]+，820.1[M+NH4]+，825.1[M+Na]+。

1.2.7 环五肽c(Leu-N-Me-Leu-Leu-Leu-N-Me-D-Leu)(a7)的合成

取保护五肽(a6)(0.15 mmol，0.12 g)溶于20 mL甲醇中，通入氮气保护后加入0.2 g 10％ Pd/C，通入氢气，室温下反应3 h。过滤回收Pd/C，滤液蒸干，干燥得产物，加入20 mL CH2Cl2溶解，冰浴搅拌下，加入5 mL TFA，冰浴下反应3 h，减压浓缩，再加CH2Cl2，减压浓缩，重复3次，再用油泵抽干得到产物，溶于25 mL THF-CH3CN-CH2Cl2(2∶2∶1)，室温下连续加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，0.134 g)、DEPBT(0.130 g)和N，N，N′，N′-四甲基异脲四氟化硼(TBTU，0.14 g)，每12 h LC-MS检测，连续反应3 d后，反应完全，减压抽干，用CH2Cl2溶解后，依次用饱和碳酸氢钠溶液、水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，用反相HPLC分离得到环五肽白色固体(a7)37.9 mg，收率42.5％。

1.2.8 环五肽c(Leu-N-Me-Leu-Leu-N-Me-Leu-N-Me-Leu)(b1)的合成

取保护五肽Boc-Leu-N-Me-Leu-Leu-N-Me-Leu-N-Me-Leu-OBn(0.15 mmol)，按照1.2.7方法，合成分离后得到环五肽白色固体(b1)35 mg,收率38.0％。

1.3 体外抗肿瘤活性筛选

采用MTT法对所合成的目标化合物进行体外细胞毒活性筛选，所选细胞株为人肝癌细胞(HepG2)、人肺癌细胞(A549)、人宫颈癌细胞(Hela)，将其抑制活性与Galaxamide进行对照。

2 结果与讨论

2.1 产物表征

2.2 环合试剂的选择

在环肽合成过程中，环合试剂的选择对目标化合物的合成至关重要，决定着关环是否成功及收率的高低，既是合成的重点也是难点。本研究选择DEPBT、HATU、TBTU作为环合试剂，溶剂体系为THF-CH3CN-CH2Cl2(2∶2∶1),对环五肽的关环效果理想。同时对文献[4]所报道的环合步骤进行改进，减少一半溶剂体积、增加一倍环合试剂用量，不仅能够提高环合的收率，同时在该反应的副产物中，含有25％～28％的五肽二聚体(环十肽)，已对该部分进行了进一步的谱图分析，以确定其结构。

2.3 分离技术及条件的选择

天然产物的全合成不仅要求合成方法得当、合成步骤合理，而且对分离技术及条件的选择要求也很高。尤其是环肽的分离，绝大部分都是用HPLC反相制备柱分离，耗费大量的时间和金钱。因此，作者对合成的中间体及目标化合物的分离采用了不同的方法和条件：(1)对线性肽中间体分别采用石油醚与丙酮、正己烷与丙酮体系为淋洗剂，硅胶柱层析分离。(2)对目标产物环肽的分离采取甲醇与水体系为淋洗剂，C18反相硅胶柱分离。经HPLC分析，产物纯度在98％以上。

2.4 体外抗肿瘤活性分析(表1)

表1 体外抗肿瘤活性比较

由表1可知：(1)含有D构型的环肽a7能增强抗肿瘤活性，可以对其进行进一步的药理研究。(2)环肽b1相比Galaxamide多了一个氮上甲基，其IC50较高，表明甲基数量的增多并不能增强环肽活性。

3 结论

以亮氨酸为起始原料，改变环合位点，全合成了两个海洋环肽Galaxamide[环(亮氨酰-N-甲基亮氨酰-亮氨酰-N-甲基亮氨酰-亮氨酰)]类似物。通过1HNMR、13CNMR、MS对其结构进行了表征，并对人肝癌细胞(HepG2)、人肺癌细胞(A549)、人宫颈癌细胞(Hela)进行了体外抗肿瘤活性的研究。结果表明，含有D构型的环肽能增强抗肿瘤活性，而环肽氮上甲基数量的增多并不能增强环肽抗肿瘤活性。

参考文献：

[1]Xu W J，Liao X J，Xu S H，et al.Isolation，structure determination，and synthesis of Galaxamide，a rare cytotoxic cyclic pentapeptide from a marine algaeGalaxaurafilamentosa[J].Org Lett，2008,10(20):4569-4572.

[2]Fairlie David P，Abbenante Giovanni，March Darren R.Macrocyclic peptide-mimetics forcing peptides into bioactive conformations[J].Current Medicinal Chemistry，1995,2(2):654-686.

[3]Aungst Bruce J，Saitoh Hiroshi.Intestinal absorption barriers and transport mechanisms，including secretory transport，for a cyclic peptide，fibrinogen antagonist[J].Pharmaceutical Research,1996，13(1):114-119.

[4]郭伟,邓攀,杨会付,等.环(亮氨酰-N-甲基亮氨酰-亮氨酰-N-甲基亮氨酰-亮氨酰)的合成[J].精细化工，2010,27(9):855-858.