赤霉素产生菌原生质体理化诱变-定向筛选模型的建立与应用

张文宣，赵 南，张金儿，朱江萍，刘义雄

(江西新瑞丰生化有限公司，江西 新干 331307)

赤霉素(俗称920)属于植物五大激素之一，是一种高效植物生长调节剂，能迅速地刺激植物的生长发育，促进植物提早开花结实，有效地打破植物种子、块茎的休眠期，促进萌发，诱导单性结实，减少棉花花蕾脱落等，在农、林、园艺等方面具有广泛的用途。随着赤霉素在啤酒生产、蔬菜水果、农林畜牧等应用领域的进一步拓展，其市场前景将更广阔。

赤霉素在我国已有近40年的生产历史，早期有较多生产水平低的专利和基础研究文献报道[1]，偶见一些综述性文献[2]，实际应用研究报道却很少，20世纪70年代成功地筛选到4303高产菌株[3]，促进了赤霉素生产的发展。随着微生物细胞工程的研究与发展，原生质体的形成、再生、融合与定向筛选技术越来越多地应用在微生物的育种过程中。李武军等[4]建立了藤仓赤霉菌原生质体形成与再生技术；刘冬华等[5]进行了原生质体的紫外线诱变育种研究。

作者在借鉴上述研究的基础上，对赤霉素原生质体的制备纯化工艺进行改进，并利用定向筛选机理，建立了赤霉素产生菌的诱变筛选模型，应用于抗药性突变高产菌株的筛选工作，取得了良好效果。

1 实验

1.1 菌株、试剂和培养基

出发菌株：藤仓赤霉菌4303-N菌株。

高渗溶液：0.7 mol·L-1NaCl溶液。

纤维素酶、蜗牛酶、果胶酶均为上海产，其余试剂均为CP或AR级。

斜面培养基(MM)：葡萄糖、硝酸钾、琼脂等。

菌丝生长培养基(MGM)：葡萄糖、甘氨酸、琼脂等。

再生培养基(RM)：蔗糖、酵母膏等。

抗性再生培养基(RRM)：在 RM培养基中添加抗性物质。

种子培养基(SM)：葡萄糖、糊精等。

发酵培养基(FM)：玉米淀粉、花生粉、黄豆粉等。

1.2 方法

1.2.1 幼嫩菌丝体的制备

从新鲜斜面上挑取少量菌丝体，放入含有石英砂、玻璃珠、生理盐水的无菌三角瓶中，摇床振荡10～20 min，得到菌丝断片悬浮液，用1 mL无菌吸管吸取菌丝断片悬浮液点种在平铺于MGM平板上的滤膜纸表面，每个平板点种1 mL(约50～80滴)，28 ℃培养1～2 d可见薄层白色菌丝时，即为幼嫩菌丝体。

1.2.2 原生质体的制备

将长有幼嫩菌丝体的滤膜纸轻轻揭下，在混合酶液中将幼嫩菌丝体漂洗下来，于28 ℃进行酶解，在酶解过程中，间歇摇动使酶解充分,定时取样，在生物显微镜下观察原生质体的形成并计数。菌丝及原生质体混合物经1500 r·min-1离心10 min，沉淀除去残留酶液,再用高渗溶液洗涤2次，用G2漏斗或脱脂棉过滤除去大部分菌丝断片，即得原生质体悬浮液。

1.2.3 原生质体的诱变

UV诱变：取原生质体悬浮液约5 mL加入无菌平皿内,置于已预热30 min的UV灯(15 W，波长253.7 nm)直下30 cm处，开盖振荡照射100 s左右。

NTG诱变：取原生质体悬浮液分别用25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、75 μg·mL-1、100 μg·mL-1NTG处理30 min，以大量稀释法终止反应。上述处理均在避光条件下进行。

取诱变处理后的原生质体悬浮液分别涂布在含致死浓度的抗生素再生平板和不含抗生素再生平板上，28 ℃恒温培养7～12 d，使抗药性突变菌株得到再生，分别统计其再生菌落数，计算致死率和突变率。

×100%

×100%

正变率为：发酵单位≥110%的正变株占总筛选菌株的百分率。

1.2.4 原生质体的定向再生

取诱变处理后的原生质体悬浮液，用高渗溶液适当稀释后，分别涂布于RM平板(测定存活率)和RRM平板上，于28 ℃恒温培养6～8 d，使抗药性突变菌株得到再生。同时取两份未经诱变处理的原生质体悬浮液，一份用高渗溶液稀释后，涂布于RM平板上作存活率对照测定；另一份用无菌水稀释以休克原生质体，涂布于RM平板上作再生率对照测定。

×100%

经实验测定,原生质体在RM再生培养基上的再生率为16%左右，待抗性再生培养平板上长出抗药性单菌落后，分别接种于MM斜面试管上，继续培养3～4 d，置于4 ℃冰箱中待筛选。

1.2.5 抗药性突变高产菌株的摇瓶筛选

将抗药性菌株进行摇瓶初筛和复筛。初筛为一级发酵,即从斜面上挖块直接种入发酵摇瓶中。复筛为二级发酵，即将斜面上菌种挖块种于种子摇瓶中于旋转式摇床上28 ℃培养30～50 h，种子液长浓后，以8%～10%移种到发酵摇瓶中。初筛和复筛的发酵摇瓶均于28 ℃摇床培养8 d后，放瓶检测发酵滤液的效价。

1.2.6 效价测定

参照文献[3]。

1.2.7 配方优化

将种子或发酵原有配方中的碳源、氮源、无机盐等各设计2～4个浓度梯度，通过正交设计及结果分析，确定各成分的具体配比。

2 结果与讨论

2.1 赤霉菌原生质体制备工艺的改进

针对赤霉菌丝为不产孢子的多核菌丝的特性，用复合破壁酶液(纤维素酶2%+蜗牛酶1%+果胶酶0.4%)对其进行处理，使菌丝细胞壁酶解破壁释放出游离的单核体(原生质体)，然后再进行诱变育种。通过混合酶液组分配比的优化调整，进一步完善了原生质体的制备纯化工艺。实验表明：采用微孔滤膜作载体、含甘氨酸的菌丝生长培养基、以幼嫩菌丝体为对象、经复合破壁酶液酶解等新工艺，能使原生质体的释放量提高一个数量级，并且其再生活性明显得以增强。正是由于原生质体制备工艺的完善与成熟，从而确保了基因突变后的遗传个体绝大部分都是纯合体，避免了高产性状经传代后水平回复的现象。

2.2 理化诱变剂诱变剂量的选择

2.2.1 物理诱变剂UV照射剂量的选择(表1)

表1 UV照射时间对赤霉素原生质体致死率的影响

从表1可以看出，随着UV照射时间的延长，原生质体的致死率增大。选择存活率在10%～20%左右，即UV照射时间90～120 s左右为原生质体的UV照射剂量。

2.2.2 化学诱变剂NTG诱变剂量的选择[6](表2)

表2 NTG诱变剂量对赤霉菌原生质体的致死率及诱变效果的影响

从表2可以看出，随着NTG诱变剂量的增加，其原生质体的致死率增大，正变率相应降低。选择正变率大、致死率超过50%的NTG诱变剂量，即25 μg·mL-1处理30 min左右为其作用剂量。

2.3 赤霉素原生质体抗药性致死突变标志诱变筛选模型的建立

单核的原生质体经过理化因子(如UV、NTG等)诱变处理后，绝大部分仍保持原有的遗传稳定性或被诱变剂直接杀死，能发生基因突变的几率相当小，而变异又大多产生负变，所需要的正突变个体就更少,如果采用传统的随机筛选法来筛选高产菌株，难以取得成功。在此采用定向筛选技术来浓缩突变型、陶汰野生型,使正变菌株得到定向再生，而负变菌株不能再生，从而大大地节省人力物力，极大地提高筛选效率。

2.3.1 定向筛选机理

抗生素产生菌在发酵过程中，当抗生素积累超过一定浓度时会导致产生菌的自杀，产生菌通过反馈抑制和反馈阻遏来限制抗生素的过量积累，进行代谢的自我调节，从而保护菌株本身[7]，由此可将赤霉菌自身产生的赤霉素作为抗性筛选物质；另外，在抗生素产生菌的遗传物质中，抗性基因与抗生素合成的结构基因和调控基因紧密连锁，因而各基因之间易发生共突变[8]，由此也可选择其它对赤霉素菌体有抑制杀菌作用的敏感抗生素(如氯霉素)作为抗性筛选物质[6]。产生菌经诱变后如能在较高浓度的赤霉素、氯霉素等抗性筛选物质存在的环境中生存，就能解除抗生素的反馈抑制和反馈阻遏，这样的菌株将能合成更多的抗生素。

2.3.2 抗性筛选物质赤霉素、氯霉素亚致死浓度的选择

将赤霉素、氯霉素分别制成0～4000 μg·mL-1的浓度梯度板，将制备好的原生质体悬浮液按每皿0.1 mL均匀涂布在该浓度梯度板上，28 ℃恒温培养4～5 d，根据再生平板上菌落生长情况，推算出赤霉素、氯霉素的大致亚致死浓度分别是3000 μg·mL-1左右和2000 μg·mL-1左右，再以此浓度为中心浓度，以100 μg·mL-1为一档次，分别向上递增和向下递减制成系列浓度平板，精确测定出赤霉素亚致死浓度为2800 μg·mL-1、氯霉素亚致死浓度为2000 μg·mL-1。

2.3.3 诱变筛选模型的建立

依据定向筛选机理，以亚致死浓度作为抗性筛选物质的加入浓度，将2800 μg·mL-1的赤霉素或2000 μg·mL-1的氯霉素准确加入到赤霉素原生质体再生培养基(RM)中，成为抗性再生培养基(RRM)，建立赤霉素产生菌原生质体抗药性致死突变标志的诱变筛选模型，通过RRM抗性再生培养基，进行定向筛选，真正达到了浓缩突变型、陶汰野生型的效果。

2.3.4 诱变筛选模型的应用

依据所建立的赤霉素产生菌原生质体抗(耐)药性致死突变标志的诱变筛选模型，进行赤霉素菌种的诱变改良，获得了N7298等多株高产诱变菌株，并推广应用于赤霉素的工业化生产。选育系谱如下：

2.4 发酵工艺的优化

高产诱变菌株与出发菌株相比，遗传基因发生了较大变化，生理、生化等遗传特征表现出一定差异，原有的发酵工艺已不能适应其生长需要，影响了其高产性能的充分表达。采用正交实验法、方差分析法、浓度梯度法、回归分析法等优化发酵配方和完善发酵工艺。通过多次配方优化，得到N7298的优化配方为：发酵培养基：碳源一3%，碳源二9%，氮源一1.2%，氮源二0.6%，无机盐一0.1%，无机盐二0%，无机盐三0.1%。无机盐二不宜加入，其它成分不变。以优化配方与原配方对N7298进行对比实验，结果见表3。

2.5 高产诱变菌株N7298的摇瓶小试与大罐试产结果

表3 优化配方与原配方摇瓶小试对比结果/%

表4 N7298与出发菌株N的效果对比/%

由表4可知，N7298菌株无论是摇瓶小试还是大罐(20 m3)试产的产量都较出发菌株N提高24%左右。如果以年产赤霉素80 t计，则年新增产量19.2 t，年新增利税960万元 (以每千克新增产品降低发酵成本500元计算)，经济效益非常显著。

3 结论

应用所建立的赤霉素诱变筛选模型，进行产生菌原生质体理化诱变-定向筛选，成功得到N7298等多株原生质体再生的抗药性突变高产菌株。N7298的摇瓶效价比出发菌株N提高23.4%、20 m3罐生产水平提高24.1%。

N7298高产诱变菌株的成功选育，为今后进一步应用诱变筛选模型、开展赤霉素选育的定向筛选工作积累了经验，且对其它抗生素产生菌的诱变筛选工作具有较广泛的借鉴意义。

参考文献：

[1] Jefferys E G.The gibberellin fermentation[J].Advances in Appl Microbiol,1970,13:283-316.

[2] 颜亨宸,宋友礼.赤霉素研制概况[J].抗生素副刊,1989，(5):10-19.

[3] 上海“九二○”菌种选育协作组.九二○产生菌4303高产株的选育[A].微生物育种学术讨论会文集[C].北京：科学出版社，1975:61-65.

[4] 李武军,郑幼霞,王洪洲,等.赤霉素产生菌藤仓赤霉菌原生质体的形成与再生[J].真菌学报,1992,11(3):221-228.

[5] 刘冬华,李伯迈,邓云珍,等.赤霉素产生菌原生质体的紫外线诱变育种[J].湖南微生物学通讯,1992，(1):15-17.

[6] 张金儿,朱江萍,刘义雄.从氯霉素抗性突变株筛选赤霉素高产菌株[J].中国抗生素杂志,2005，(5)：301-303.

[7] 盛祖嘉.微生物遗传学[M].北京:科学出版社,1984:467-468.

[8] 涂国全,刘姝,黎循航.梅岭霉素高产菌株链霉烂抗生基因突变株筛选[J].微生物学通报,2002，(6):33-37.