分光光度法测定黄花草木樨中总黄酮含量

汤春妮，闫晓前，马喜锋，张军科

(陕西国防工业职业技术学院，陕西 西安 710302)

黄花草木樨(Melilotus)为豆科(Leguminosae)草木樨属(MelilotusMill.)一年生或两年生草本植物，在我国分布广泛[1]，其全草具有抗炎抗菌、改变血管通透性、促进血液循环、改善血管平滑肌、调节免疫、抗氧化和清除自由基等药理作用[2,3]。黄花草木樨含有香豆素类、黄酮类、酚酸类、甾体类、三萜类、糖类、蛋白质类等化学成分，其中黄酮类化合物是主要功效成分之一[4～8]。目前，国内对黄花草木樨中总黄酮含量测定方法的研究报道甚少[9]。分光光度法常用来测定植物中总黄酮含量。黄酮类化合物本身在紫外光谱区具有吸收带，但存在较多干扰，故通过NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 比色法[即黄酮类化合物在亚硝酸盐存在的碱性条件下与Al(NO3)3形成稳定的红色配合物]使其吸收带位移至可见光区进行测定，以较少干扰测得以芦丁为标样的总黄酮含量。作者采用分光光度法测定黄花草木樨中总黄酮的含量，以期为黄花草木樨中总黄酮的开发提供依据。

1 实验

1.1 试药、试剂与仪器

芸香叶苷(芦丁)，生化级，中国医药上海化学试剂公司；其余所用试剂均为分析纯；市购草木樨，经鉴定为黄花草木樨M.officinalisL.Desr。

UV-9200型紫外可见分光光度计，北京瑞利分析仪器公司；BP211D型电子天平，SARTORLUS；DF-101S型集热式恒热加热磁力搅拌器，上海东尔制冷仪器设备有限公司；KQ3200型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；LDA-2型低速离心机，北京医用离心机厂。

1.2 供试品溶液的制备

方法一(热回流提取法)：精密称取粉碎过筛的草木樨药材1.0000 g，加入30 mL 80%甲醇溶液，在60 ℃下回流提取2 h，离心分离，共提取3次，合并滤液定容至100 mL作为供试品溶液备用。

方法二(超声波提取法)：精密称取粉碎过筛的草木樨药材1.0000 g，加入30 mL 80%甲醇溶液，常温下超声提取40 min，离心分离，共提取3次，合并滤液定容至100 mL作为供试品溶液备用。

方法三(冷浸提取法)：精密称取粉碎过筛的草木樨药材1.0000 g，加入30 mL 80%甲醇溶液，常温下提取24 h(前6 h时时振摇，后18 h静置)，离心分离，共提取3次，合并滤液定容至100 mL作为供试品溶液备用。

1.3 标准曲线的绘制[10,11]

精确称取芦丁10.0 mg(105 ℃烘干至恒重)，用80%的甲醇溶解并定容至100 mL，得0.1 mg·mL-1的芦丁标准储备液，备用。精密量取芦丁标准储备液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL置于10 mL容量瓶中，分别加入5% NaNO2溶液0.3 mL，静置6 min，再分别加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL，静置6 min，最后加入4% NaOH溶液4 mL，用甲醇定容至10 mL，静置20 min；以相应试剂为空白，用紫外可见分光光度计在510 nm处测定吸光度值。结果表明，芦丁在10～50 μg·mL-1浓度范围内，吸光度值与浓度呈良好的线性关系：A=0.0128c-0.0194(R=0.9992)。

1.4 样品含量的测定

分别精密吸取按1.2项方法制备的供试品溶液2.0 mL置于10 mL容量瓶中，按1.3项操作，测定吸光度，计算总黄酮含量。

2 结果与讨论

2.1 精密度实验

精密量取6份芦丁标准储备液各3.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，按1.3项操作，测定吸光度分别为0.372、0.373、0.371、0.375、0.372、0.371，平均值为0.372，RSD=0.41%。表明方法的精密度良好。

2.2 稳定性实验

精密吸取供试品溶液2.0 mL，置于10 mL容量瓶中，按1.3项操作，每隔10 min测定1次吸光度，共测6次，吸光度分别为0.348、0.347、0.346、0.344、0.343、0.341，平均值为0.345，RSD=0.77%。表明供试品溶液在显色后60 min内稳定性良好。

2.3 重现性实验

取同一批草木樨药材6份，按1.2项方法一制备供试品溶液，精密吸取制备的供试品溶液2.0 mL，置于10 mL容量瓶中，按1.3项操作，测定吸光度分别为0.346、0.349、0.345、0.344、0.340、0.343，平均值为0.345，RSD=0.88%。表明方法的重现性良好。

2.4 回收率实验

精密量取9份已知含量的供试品溶液(方法一)1.0 mL至10 mL容量瓶中，再分别准确加入芦丁标准储备液1.1 mL、1.4 mL、1.8 mL，进行3组平行实验，每组3份，按1.3项操作，分别测定吸光度，计算回收率，结果见表1。

由表1数据计算，平均回收率为99.19%、RSD为0.79%，表明方法的回收率良好。

2.5 样品含量测定

按1.2项方法制备供试品溶液，精密吸取2.0 mL置于10 mL容量瓶中，按1.3项操作，分别测定吸光度，结果见表2。

由表2可知，与超声波提取法、冷浸提取法相比，热回流提取法提取黄花草木樨中总黄酮的效果最好，其平均含量为1.44%，这可能与黄花草木樨中含有的黄酮类化合物的种类与结构有关。因此， 确定热回流提取法为测定黄花草木樨中总黄酮时的提取方法。

表1 回收率实验结果

表2 不同提取方法的总黄酮含量测定结果

3 结论

采用分光光度法测定黄花草木樨中总黄酮含量，操作简便、准确、可靠、稳定性和重现性好，可用于黄花草木樨中总黄酮的含量测定。

参考文献：

[1] 杨玉凤.耐旱耐瘠的先锋牧草草木樨[J].北京农业，2003，(10)：26-27.

[2] 张海峰，高成富，卢柳燕.草木樨提取物的制备及其抑菌作用[J].中药材，2009，32(1)：131-134.

[3] 魏刚.草木樨属植物药理作用研究进展[J].湖北中医杂志，2009，31(11)：79-80.

[4] Bubenchikova V N，Drozdova I L.HPLC Analysis of phenolic co-mpounds in Yellow Sweet-Clover[J].Pharm Chem J，2004，38(4)：195-196.

[5] Kang S S，Lee Y S，Lee E B.Saponins and flavonoid glycosides from Yellow Sweet Clover[J].Arch Pharmacal Res，1988，11(3)：197-202.

[6] 康菊珍.藏药草木樨的化学成分研究[J].西北民族大学学报(自然科学版)，2009，30(3)：40-41.

[7] Maeias F A，Simonet A M，Galindo J G，et al.Bioactive polar triterpenoids fromMelilotusmessanensis[J].Phytochemistry，1998，49(3)：709-717.

[8] 李静.黄花草木犀香豆素类和黄酮类化学成分研究[D].武汉：湖北中医学院，2007.

[9] 高成富，张海峰.草木樨提取物中香豆素、总多酚、黄酮的测定[J].科协论坛，2008,(7)：58-59.

[10] 林亮.化香树果序黄酮类化合物提取、分离及抑菌活性研究[D].西安：西北大学，2009.

[11] 姜秀娟,唐金成,白红进.可见分光光度法测定刺山柑花蕾中总黄酮含量[J].食品科学，2010，31(18)：252-254.