柱穗山羊草类燕麦储藏蛋白基因克隆和序列分析

杜旭烨　周婷婷　许骥坤　郭伟华　赵小龙　翟军　孔令让

摘 要：从小麦近缘植物柱穗山羊草中克隆得到一个特殊的类燕麦储藏蛋白（Avenin-like protein）基因。其编码区比已知的类燕麦储藏蛋白编码基因长200 bp左右，是迄今发现的最大的类燕麦储藏蛋白，将其命名为AL-Y127。通过与已知的类燕麦储藏蛋白基因比较后发现，该蛋白家族在信号肽、N末端和C末端具有很高的保守性，而在重复区中则具有较大的序列差异。AL-Y127中有26个半胱氨酸残基，远多于已知的avenin-like蛋白中的半胱氨酸残基数目，这些半胱氨酸残基可能会参与形成更多的二硫键，有利于提高面粉的加工品质。

关键词：类燕麦储藏蛋白；基因克隆；序列分析

中图分类号：Q785 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2012）11-0001-05

Cloning and Sequence Analysis of Novel Avenin-Like Genes

from Aegilops cylindrical

Du XuYe1， 2， Zhou TingTing1， Xu JiKun1， Guo WeiHua1，

Zhao XiaoLong1， Zhai Jun1， 2， Kong LingRang1， 2*

（1.Agronomy College， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China；

2.State Key Laboratory of Crop Biology， Taian 271018， China）

Abstract A novel avenin-like gene was cloned from Aegilops cylindrical. Its coding region the gene was 200 bp longer than that of published avenin-like gene and it was named AL-Y127. This gene is the largest avenin-like gene so far. It showed that the signal peptide， N-terminal domain and C-terminal domain of avenin-like protein were highly conservative by comparing AL-Y127 and the other published avenin-like proteins. The repetitive domain displayed more variation based on protein sequence alignment. There were 26 cysteine residues in AL-Y127， which were much more than these of the avenin-like proteins in other species； they may form more disulfide bond which have the positive role in the processing quality of flour.

Key words Avenin-like proteins； Clone； Sequence analysis

小麦籽粒的储藏蛋白主要包括谷蛋白和醇溶蛋白，谷蛋白是多聚体蛋白，由分子内部的二硫键结合形成蛋白聚合体；而醇溶蛋白是一类单体蛋白，根据其在酸性电泳中的迁移率可以分为α、γ和ω醇溶蛋白三类。

类燕麦储藏蛋白是最近几年引起人们关注的一类储藏蛋白。最初，Salcedo等[1]报道了一种低分子量的醇溶蛋白，随后Anderson和Clarke[2，3]得到了此类蛋白的cDNA序列，Kan等[4]分析后认为此类蛋白与燕麦种子的储藏蛋白具有最近的亲缘关系，因此将其命名为类燕麦储藏蛋白（Aevnin-like protein）。根据其结构可将其分为两类：a型和b型类燕麦储藏蛋白。

序列分析表明，a型类燕麦储藏蛋白类似于低分子量谷蛋白亚基，通过蛋白组学分析和蛋白质分离已经得到了该类型的类燕麦储藏蛋白。目前对b型类燕麦储藏蛋白的研究较少，Kan等[4]发现，一些b型类燕麦储藏蛋白中含有19个半胱氨酸残基，认为它们可以通过分子链内的二硫键结合到谷蛋白聚合体中。

柱穗山羊草（CCDD）是小麦的近缘植物之一，由于其外形与粗山羊草十分相似，因此常常被误认为是粗山羊草。目前对它的研究较少。本文从柱穗山羊草中克隆得到了一个特殊的类燕麦储藏蛋白基因，并对其编码序列及氨基酸序列进行了分析。

1 材料与方法

11 供试材料

柱穗山羊草京Y127，由中国农业科学院作物科学研究所提供。Trans T1感受态细胞、pEASY-T1克隆载体、Hifi Taq高保真酶均购于北京全式金公司。基因组DNA提取试剂盒、DNA凝胶纯化试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司。

12 方法

121 基因组DNA提取 以室内生长2周的幼叶为材料，利用基因组DNA提取试剂盒提取DNA，操作方法依照试剂盒内说明书进行。

122 基因克隆及序列测定 根据GenBank公布的avenin-like蛋白编码基因的保守序列（表1）

表1

引物设计的参考序列

基因来源 GenBank登录号

小伞山羊草 EU096528

柱穗山羊草 EU096537

长穗偃麦草 EU096540

双角山羊草 EU096546

普通小麦 HM027637

普通小麦 JN542459

设计引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成。引物序列如下：P1：5′-ATGAAGGTCTTCATCCTGGCT-3′；P2：5′-CTAGCACGCACCACCAGT-3′。该引物可覆盖avenin-like蛋白编码基因的起始密码子至终止密码子的编码区。

123 序列分析 利用http：//webexpasyorg/translate/在线工具进行氨基酸序列的翻译；DNAMAN 60软件用于序列的多重比对分析。

2 结果与分析

21 柱穗山羊草类燕麦储藏蛋白基因的PCR扩增

利用特异性引物经PCR扩增，获得了一条大小约为1 000 bp的条带（图1），经菌落PCR鉴定后（图2），随机选择10个单菌落进行测序。测序结果经多重序列比对后，确定得到两个avenin-like蛋白编码基因，其中一个为从未报道过的新基因，命名为AL-Y127。

注：1，DNA ladder；2，avenin-like蛋白编码基因PCR扩增产物。

图1 PCR扩增产物

22 与已知序列的比较分析

经过与已知的avenin-like蛋白编码基因进行比较（表2）发现，本试验所得到的编码基因长

注：M，DNA ladder；1～12， 菌落PCR产物，其中泳道12为AL-Y127。

图2 菌落PCR

度大于已知的此类基因，同时其半胱氨酸的残基数目较多，为26个，而在已知的avenin-like蛋白编码基因中，半胱氨酸残基数目最多为19个。因此，本试验得到的蛋白可以形成更多的二硫键，有利于提高面粉的加工品质。

与已知的avenin-like蛋白进行多重序列比对（图3）发现，此类蛋白有保守的信号肽、N-末端以及C-末端，而主要的变异几乎全部来自重复区。只是AL-Y127的重复区更长。

表2 AL-Y127与已知类燕麦储藏蛋白的

序列比较

蛋 白 氨基酸数目 半胱氨酸残基数目 等电点 分子量（ku）

AL-Y127 404 26 696 4624

EU096528 284 18 783 3233

EU096537 284 18 843 3233

EU096540 284 18 783 3233

EU096547 284 19 781 3201

HM027637 284 18 783 3236

JN542459 284 18 741 3239

注：Ⅰ，信号肽；Ⅱ，N-末端；Ⅲ，重复区；IV，C-末端；箭头，保守的半胱氨酸残基；方框，AL-Y127中额外的半胱氨酸残基。

图3 AL-Y127与已知的avenin-like蛋白多重序列比对

3 讨论与结论

为了研究柱穗山羊草中的avenin-like蛋白，本试验从柱穗山羊草京Y127中分离出一个迄今未见报道的高分子量的avenin-like蛋白，其编码基因为1 212 bp，表达的蛋白质由404个氨基酸残基组成，比已知的avenin-like蛋白的氨基酸多100多个；其半胱氨酸残基的数目多达26个，比同家族的蛋白多8个左右，比大多数的高分子量谷蛋白亚基多约20个。陈瑞佶等[5]认为，avenin-like蛋白中的半胱氨酸残基所形成的二硫键既可以形成分子内二硫键，也可以和其他的储藏蛋白形成分子间二硫键。目前对小麦储藏蛋白中二硫键的作用已经形成了广泛的共识，即二硫键的数目和位置会直接影响面粉的加工品质，因此，avenin-like蛋白对改良小麦品质具有重要的潜力。

Salvatore等[6]认为，avenin-like蛋白作为小麦的储藏蛋白，与已知的小麦储藏蛋白表现出一些共性，例如在其编码基因的结构上，两端均为保守序列，变异发生在重复区中。本试验的多重序列比对表明（图3），AL-Y127与已知的avenin-like蛋白序列的差异主要体现在重复区中，而在信号肽、N末端以及C末端的序列则相对保守。陈鹏等[7]研究发现，avenin-like蛋白基因属于多基因家族，因此，上述的分子结构为此类基因的同源克隆创造了条件，利于从更多的材料中克隆出该基因并进行功能分析。

本试验克隆获得的avenin-like蛋白基因具有高分子量以及高半胱氨酸含量，其结构分析表明该蛋白为一个优质蛋白，而对于其具体的功能以及利用该蛋白改良小麦的品质还有待于进一步的研究。

参 考 文 献：

[1] Salcedo G， Prada J， Aragoncillo C Low MW gliadin-like proteins from wheat endosperm[J] Phytochemistry，1979，18（5）：725-727

[2] Anderson O D， Hsia C C， Adalsteins A E，et alIdentification of several new classes of low-molecular-weight wheat gliadin-related proteins and genes[J] Theoretical and Applied Genetics ， 2001， 103（2-3）： 307-315

[3] Clarke B C， Phongkham T， Gianibelli M C，et al The characterization and mapping of a family of LMW-gliadin genes： Effects on dough properties and bread volume[J] Theoretical and Applied Genetics ， 2003， 106（4）： 629-635

[4] Kan Y C， Wan Y F， Beaudoin F， et alTranscriptome analysis reveals differentially expressed storage protein transcripts in seeds of Aegilops and wheat[J] Journal of Cereal Science， 2006， 44（1）： 75-85

[5] 陈瑞佶，高 翔，陈其皎，等小麦品种陕253新型Avenin-like的克隆与原核表达分析[J]中国农业科学， 2010， 43 （9）： 1954-1962

[6] De Caro S，Ferranti P，Addeo F，et al Isolation and characterization of Avenin-like protein type-B from durum wheat[J]Journal of Cereal Science， 2010， 52（3）： 426-431

[7] 陈 鹏， 李 茹， 金 刚， 等 三芒山羊草中新型储藏蛋白基因Avenin-like的克隆及分析[J] 生物技术， 2009， 19（4）： 1-3 山 东 农 业 科 学 2012，44（11）：12～16