西安交通大学医学院第二附属医院妇产科(西安710004) 薛 翔 韩红芳 段 钊 公丕军
宫颈癌为妇科最常见的肿瘤,近年的发病有明显的年轻化趋势,过去宫颈癌治疗以手术和放疗为主,但对部分有生育要求的病人,手术和放疗均存在很大的局限[1];随着新辅助化疗的提出,近年来,宫颈癌的化疗取得了较好的治疗效果;宫颈癌的化疗方案有多种,卡铂联合多西他赛为最近提出的一种方案,我们通过检测survivin表达对该方案的作用机理进行研究。
1 材 料 选择我院2009年1月至2011年6月行静脉+手术治疗且临床分期为Ⅰb~Ⅱb期宫颈癌患者60例。年龄23~62岁,平均44.5岁,其中≤40岁15例。鳞癌55例,腺癌5例。
2 治疗方法 所有病人入院后,两名副主任医师以上医师对病人进行临床分期。化疗前取活检,活检癌肿放入-80℃冰箱保存。所有患者均采用静脉化疗方案:多西他赛75mg/m2溶于0.9%氯化钠液250ml中,第1天静脉滴注1h;卡铂350mg/m2,用生理盐水溶解后,再稀释至500ml,静脉滴注,滴注时间不应少于1h,滴完后需继续点滴输液1000ml以上,第1天化疗,然后水化2d,间隔3周再次重复。所有病例均化疗3个疗程后,根据肿块缩小情况选择手术或者放疗。
3 RT-PCR半定量分析 引物均由上海生物公司合成。survivin引物为:上游引物:5’-AGGCTGGCTTCATCCACT-3’, 下 游 引 物:5’-CACCAAGGGTTAATTCTTCA-3’,产物长度180bp。上游 引 物:5’-CCAGAGCAAGAGAGGCATCC-3’,下游引物:5’-CCGTGGTGGTGA AGC TGT AG-3,总长度437bp。组织总RNA提取按照Trizol(Qiagen,USA)剂盒说明书的操作步骤,按1×107/ml Trizol的比例提取组织总RNA;按照翻转录试剂盒(MBI,USA)说明书在20μl的反应体系中合成细胞总cDNA;PCR体系为50μl,内含模板2μl,Taq酶5U(TAKA-RA,Japan),目的引物各1μl,补足为50μl。反应条件除退火温度外均为预变性94℃4min,变性94℃30s,退火30s,延伸72℃30s,25个循环数。退火温度依次为survivin为59.5℃,β-actin为57.5℃。
4 细胞凋亡检测 人宫颈癌组织活检或者手术切除离体半小时内,含1000U/ml的青霉素(Gibco,USA)和1000μg/ml链霉素(Gibco,USA)PBS冲洗以去除污染的红细胞;将其剪成小碎片,0.5mg/ml胶原酶IV+DMEM/F12(Gibco)、37℃中消化过夜,1500g离心,弃 上 清,0.025mmol/L EDTA-胰 酶 (Gibco,USA)37℃消化半小时,用去离子水按1∶4稀释结合缓冲液(20ml结合缓冲液+60ml去离子水)。用250μl结合缓冲液重新悬浮细胞,使其浓度为1×105/ml。加100μl的细胞悬液入5ml流式管中,每管加入5μl Annexin V/FITC和5μl 20μg/ml的 PI,避光混匀,标记15min。对照不加Annexin V作校正因子。在反应管中加入400μl PBS。用流式细胞仪(FACS)检测,光源为488nm氩离子激光器,FITC受激发后发绿色荧光,PI发红色荧光。
5 统计学处理 数据均采用SPSS11.0统计软件进行统计。细胞凋亡和增殖指数用均数±标准差表示。采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
化疗3个疗程后,绝大多数患者肿块明显缩小(53/60,88.3%)。RT-PCR 检测survivin表达,化疗后survivin表达明显下降,即使肿瘤缩小不明显的患者,其survivin表达亦明显下降;细胞凋亡明显增加。见附表。
附表化疗前后survivin的表达及肿瘤细胞凋亡率
宫颈癌发病率在女性恶性肿瘤中仅次于乳腺癌居第2位,在发展中国家妇女中其发病率居第一位[1-2]。因为宫颈癌病人的年轻化,传统的手术后病人无法生育,而放疗又对卵巢功能有很大的影响[3],使人们意识到了宫颈癌给予化疗的可能性。早在1982年Frei提出肿瘤手术前早期辅助化疗的概念以来[4],宫颈癌化疗的方案也越来越多,化疗以后的效果,越来越受到国内外学者的重视[4]。
多西他赛是半合成的紫杉类抗肿瘤药,抗瘤谱较紫杉醇广,可以与游离微管蛋白结合,促进微管蛋白组装成稳定的微管,其作用是紫杉醇的2倍,并抑制其解聚,从而抑制细胞有丝分裂,另外多西他赛还是一种有效的Bcl-2磷酸化诱导剂,可以诱导Bcl-2蛋白过度表达的实体瘤细胞凋亡。常见的主要剂量限制性毒性为迟发性腹泻和中性粒细胞减少,其它的毒性反应为胆碱能综合征,恶心、呕吐、乏力、脱发。卡铂为铂的金属络合物,作用似烷化剂,主要作用靶点为DNA,作用于DNA链间及链内交链,形成DDP-DNA复合物,干扰DNA复制,或与核蛋白及胞浆蛋白结合。属周期非特异性药,主要副作用为消化道反应、肾毒性、骨髓抑制[5]。
生存素(surviving)是新近发现的一种肿瘤特异性凋亡抑制基因,是凋亡抑制蛋白(IAP)家族新成员,具有抑制细胞凋亡和调节细胞分裂的双功能蛋白,同时参与血管形成的作用[6]。survivin可抑制多种凋亡刺激因子引起的凋亡,是迄今发现的最强的凋亡抑制因子[7]。survivin和其他IAP蛋白的分布和表达模式不同,其他IAP蛋白在生理情况下广泛分布于成人各种组织中,不同之处仅为表达水平的不同;survivin仅表达于胚胎和胎儿发育过程中,并且随着胚胎组织的发育成熟,survivin的分布逐步局限,表达水平逐渐降低直至不表达。在正常成人,除了在胎盘、胸腺、增生期和分泌期的子宫内膜中有较弱的表达外,其余正常分化成熟组织均未发现。survivin在几乎所有的癌组织中均有表达。文献报道的宫颈癌的survivin的表达35%~90%,survivin蛋白的表达率和表达量与肿瘤不良预后、临床分期、淋巴结转移和肿瘤周围浸润成正相关[8]。现有研究表明肿瘤的发生发展不仅是细胞增殖失控、分化异常的结果,而且与细胞凋亡失衡有关。多种因素综合作用,导致细胞过度增殖和(或)凋亡抑制,进而造成细胞无限生长,从而形成肿瘤。survivin是新近发现的一种凋亡抑制基因,其独特的结构、特殊的组织分布和作用机制及明显的抗凋亡作用尤为引人注目;survivin与细胞凋亡指数成负相关[9]。
新辅助术前化疗(NACT)的目的一是希望化疗后局部肿瘤缩小,从而可减少切除范围,降低手术造成的损伤;其次是化疗可清除或抑制可能存在的微转移灶,从而改善预后。但是NACT的确切机制尚不清楚,我们推测肿瘤的发生、发展是多基因相互作用的结果。新辅助化疗的分子机制已经有了一系列的研究,发现其可以下调部分肿瘤基因的表达,促进肿瘤细胞凋亡。本研究表明卡铂联合多西他赛可有效抑制survivin表达,引起肿瘤细胞凋亡,从另外一个角度对宫颈癌的辅助化疗机制进行了探讨,而且奈达铂联合伊立替康在宫颈癌化疗中的良好效果,亦说明这种化疗方案值得在临床上进一步推广,而这种方案引起宫颈癌中survivin的表达下调亦说明了其的一部分作用机理。
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