miR－3960真核表达载体的构建及其对成骨细胞矿化的影响＊

陕西省人民医院（西安710068） 李 辉 郭 剑 张 艳 庞雅玲 李晓燕 吴贵福

miRNAs是一类小的单链内源性非编码RNA，能够与靶mRNA的特定序列结合，通过降解靶mRNA或抑制翻译发挥其重要的调控作用。目前研究已发现miRNAs在细胞分化与凋亡、生长发育、糖脂代谢、炎症、免疫应答以及肿瘤发生等多个生理和病理过程中均扮演着关键的角色［1－2］，其在成骨细胞分化调控过程中的作用也已被多个实验证实。miR－3960是最近发现的一个新的在成骨细胞表达的miRNA，其表达水平随成骨细胞的分化进程而逐步增加，提示其可能在成骨细胞分化过程中发挥一定作用。为明确miR－3960对成骨细胞矿化的影响，本研究将miR－3960的前体序列克隆入真核表达载体pSilencer 4.1－CMV puro中，并将其稳定转染ST2细胞，观察miR－3960对成骨细胞矿化的影响，为深入研究miR－3960在成骨细胞分化中的作用机制奠定基础。

材料与方法

1 材 料 pSilencer 4.1－CMV puro载体购自美国Ambion公司。rTaq DNA聚合酶、T4DNA连接酶购于大连宝生物公司。BamH I、Hind III内切酶购自美国NEB公司。DNA胶回收试剂盒购自美国QIAGEN公司。小鼠基质细胞ST2购买自日本RIKEN生物资源中心；α－MEM培养基及胎牛血清（FBS）购自美国GIBICO公司。人重组BMP－2蛋白购于美国Peprotech公司。Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。其余试剂均为国产分析纯。

2 方 法 ①miR－3960表达载体的构建：根据miR－3960的前体序列设计引物，两条引物的5′分别含有BamH I和Hind III酶切位点，引物由上海英骏生物技术公司合成并纯化。P1：5’－GATCCGGCCACGGCTTCCTGCGCCCCCGATCGGGGCCGCCAACA GCGCTGGCGGCGGCGGCGGAGGCGGGGGCAGT GGCGGAAA－3’；P2：5’－AGCTTTTCCGCCACTGCCCCCGCCTCCGCCGCCGCCGCCAGCGCTGTT GGCGGCCCCGATCGGGGGCGCAGGAAGCCGT GGCCG－3’。将合成的两条寡核苷酸用去离子水稀释成100μmol/L，各取2μl，与46μl退火缓冲液混合，95℃4min，70℃10min，30℃30min，缓慢降温至4℃得到退火双链DNA。随后对pSilencer 4.1－CMV puro进行线性化：用BamH I和Hind III对质粒进行双酶切，反应体系为：质粒10μl，10缓冲液4μl，BamH I 2μl，Hind III 2μl，去离子水22μl，37℃酶切3h，酶切产物经1%琼脂糖胶电泳，用DNA胶回收试剂盒回收线性载体片段。将线性化质粒与退火后的产物于16℃连接过夜。制备感受态细胞大肠杆菌DH5α，连接产物转化DH5α感受态细胞，在氨苄青霉素抗性LB平板上筛选重组载体。扩增白色的抗性菌落，提取质粒并以BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切鉴定重组质粒。把酶切鉴定正确的重组质粒送南京金思特公司使用pSilencer 4.1－CMV puro通用引物进行测序，质粒命名为pSilencer4.1－miR－3960。②小鼠基质细胞ST2培养：细胞在含有10%FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的α－MEM中培养。细胞置于37℃、饱和湿度及5%CO2条件下培养。每周换液2次，以0.25%胰蛋白酶消化传代。当诱导ST2向成骨细胞分化时在培养基中加入300ng/ml BMP－2。③pSilencer4.1－miR－3960稳定转染ST2细胞：ST2细胞或BMSCs以3×104细胞/孔的密度接种24孔板，加入不含抗生素的α－MEM培养液培养至细胞汇合达到70%左右时进行转染。取pSilencer4.1－miR－3960 0.8μg，Lipofectamine 2000 2μl用50μlα－MEM 稀释，轻柔混匀，室温孵育5min；将以上两液体轻轻混匀，室温静置20min，使脂质体包裹质粒；轻柔混匀转染液体，慢慢滴入培养板中，轻微晃动培养板后放入37℃5%CO2培养箱中，培养48h后加入嘌呤霉素（1μg/ml）进行筛选，待大部分细胞死亡，并有阳性克隆长出时，在显微镜下选定抗性克隆并予以标记，用无菌枪头刮吸克隆生长的细胞，转入25ml培养瓶扩大培养。转染空质粒（miR－C）为对照组。④Northern杂交：将RNA样品加入等体积的凝胶上样缓冲液，65℃热变性10min后立即于冰上放置1min，加入15%的尿素变性聚丙烯酰胺凝胶的上样孔中，180V电压电泳至溴酚蓝指示带到达凝胶底部，取下凝胶，在含1μg/ml EB的0.5×TBE中浸泡5min，漂洗3～5min，用紫外凝胶成相系统检测RNA的完整性及电泳情况。随后使用半干电转移装置，400mA恒流转1h，取出尼龙膜在0.5×TBE溶液中漂洗数秒，置于滤纸上晾干，紫外线交联125mJ。将膜置于杂交管中，加入10ml完全溶解的Hyb杂交液，于37℃预杂交1h，然后换用10ml已加入溶解的探针并充分混匀的Hyb杂交液，于37℃杂交过夜；用2×SSC，0.1%SDS溶液在室温漂洗2次，再用0.5×SSC，0.1%SDS于室温洗膜1次。压片，－70℃X光曝光24～48h，显影、定影。选用U6为内参照，同一张膜经洗脱后，加U6探针按上述步骤杂交显影。⑤钙沉积量测定：ST2细胞转染后，用α－MEM培养液培养于24孔板，其中含10%FBS、青霉素50U/ml、庆大霉素50μg/ml、BMP－2 300ng/ml、抗坏血酸50mg/ml以及10mMβ－甘油磷酸钠，培养5d后进行钙沉积量测定。用不含Ca2＋、Mg2＋的PBS洗细胞3次，每孔细胞加入500μl 0.6NHCl，4℃慢摇过夜，第2天收集每孔液体，1000g离心5min，取上清与1ml o－cresolphthalein－complex混匀后用分光光度计在575nm波长下测量。

3 统计学处理 各实验独立重复3次，重复性好，所选图表为重复实验的结果之一。所有统计分析均采用SPSS13.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较用方差分析，P＜0.05认为有统计学差异。

结 果

1 miR－3960表达载体鉴定 按miR－3960前体设计引物，将合成的两条寡核苷酸引物退火，形成双链后连接pSilencer 4.1－CMV puro载体，转化DH5α细菌，抽提质粒，采用HindIII及BamHI双酶切鉴定，由图1可见酶切释放大小分别为4.8kb和73bp的两个片段，与预期相符。随后质粒送交南京金思瑞公司测序证实序列正确（图2），证明载体构建成功。

图1 pSilencer4.1－miR－3960表达载体酶切图

图2 miR－3960连接pSilencer 4.1－CMV puro经酶切后测序图谱

2 Northern印记杂交检测miR－3960表达 图3显示在分别转染miR－3960表达载体及miR－C 48h后，两组BMP－2诱导的ST2细胞中 miR－3960的表达差异。Northern印记杂交的结果显示，pSilencer4.1－miR－3960组中miR－3960有较强的表达，而对照组中则未检测到miR－3960表达。表明miR－3960表达载体的转染成功实现miR－3960在BMP－2诱导的ST2细胞中的过表达。

图3 转染miR－3960表达载体或miR－C的BMP－2诱导ST2细胞中miR－3960的表达

3 miR－3960对成骨细胞矿化的影响 稳定转染pre－miR－3960后用BMP－2持续诱导ST2向成骨细胞分化5d，用邻甲酚酞络合铜比色法检测细胞中钙沉积量。如图4所示，miR－3960过表达的细胞在同样诱导条件下对钙沉积量的增加作用较对照组显著。

图4 miR－3960过表达对ST2细胞钙沉积量的影响

讨 论

近年来的研究发现多个miRNA参与调控成骨细胞的分化，如miR－26a能作用于SMAD1发挥对成骨分化的抑制作用［3］。miR－133和 miR－135分别作用于Runx2和SMAD5，抑制二者表达，进而抑制成骨细胞的分化［4］。而 Mizuno等［5］发 现 miR－210 能 够 促 进ST2细胞向成骨细胞分化，其机制是miR－210抑制AcvR1b，从而抑制TGF－beta/activin信号通路。我们之前的研究也证实一个在成骨细胞高表达的miRNA——miR－2861可以通过抑制HDAC5的表达来发挥其促进成骨细胞分化的作用［6］。本研究选取另一个在成骨细胞高表达的miRNA——miR－3960作为研究对象，成功构建miR－3960的表达载体，并将其稳定转染于ST2细胞，明确其可以促进成骨细胞的矿化。

miRNA的产生过程是一个由多个酶介导的多步骤的过程［7］。首先在体内生成长度在100～1000nt的初级转录物（pri－miRNA），随后被剪切成长度约在65～100nt并具有茎环结构的miRNA前体（pre－miRNA），再由ATP依赖的核酸内切酶Dicer将其剪切成19～26nt长的miRNA。只有成熟的miRNA才能通过与靶mRNA的特定序列结合，进而负性调控靶基因表达。

根据miRNA生成过程的这一特点，要达到在细胞中达到过表达miRNA的目的，通常需要扩增miRNA发夹结构及一些侧翼序列，并直接克隆PCR产物，将该产物连接到质粒或病毒载体，然后将其转染进入细胞，由细胞内Dicer作用后生成成熟的miRNA，这符合miRNA的一般生物合成过程和作用原理，效果稳定。本研究选取pSilencer 4.1－CMV作为连接载体，该载体上携带有RNA聚合酶II启动子，其连接发夹结构的siRNA转染细胞来获得siRNA表达已被广泛应用。miR－3960的前体pre－miR－3960长度为73 bp，根据miRbase数据库中提供pre－miR－3960序列，我们设计了一对引物，并在引物的5’端分别加了BamH I和HindⅢ酶切位点，退火后得到含酶切位点的pre－miR－3960，随后用BamH I和HindⅢ进行酶切后，将其克隆至pSilencerm4.1－CMV puro载体中构成miRNA－3960的表达质粒。将该质粒送交公司经测序证实序列完全正确。随后将该表达载体稳定转染于ST2细胞后，检测到miR－3960表达水平显著增加，进一步证实载体构建成功。这说明pSilencer 4.1－CMV用来构建miRNA表达载体是有效可行的。Lee等［8］用pSilencer 4.1－CMV构建的 miR－15a表达载体转染PCK－CCL细胞后同样能够使miR－15a在细胞内高表达。为明确miR－3960对成骨细胞矿化的影响，本研究选取钙沉积量作为观察指标。在ST2细胞中稳定转染miR－3960表达载体，并加用BMP－2诱导ST2细胞向成骨细胞分化，结果表明miR－3960过表达组钙沉积量明显增加，提示miR－3960可以促进成骨细胞矿化。

综上，本实验成功构建了miR－3960的表达载体，且实验证明其可以促进成功细胞的矿化，为进一步研究miR－3960在成骨细胞分化中的作用提供了较好的实验基础。由于miRNA发挥调控作用是通过与靶mRNA的特定序列结合来实现的，因此下一步我们将研究其可能作用的靶基因，深入探讨miR－3960在成骨细胞分化中的作用机制

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