四磨汤对胃肠道Cajal间质细胞的体外增殖干预作用

王颖航，郭淑婷，牛锦铭，刘宏岩

(1.长春中医药大学附属医院,吉林 长春,130021；2.长春中医药大学,吉林 长春 130117)

四磨汤又名四磨饮，《济生方》卷二记载由人参、槟榔、沉香、天台乌药组成，能破滞降逆，补气扶正，治七情伤感、上气喘息、妨闷不食，诸药合用，可奏顺气降逆，消积止痛之功。文献报道[1-2]显示，四磨汤作为促胃肠动力中药得到广泛使用，临床上的应用已涉及到内、外、妇、儿等各科，且取得了较好的疗效。四磨汤对于胃肠动力障碍性疾病有明显调节胃肠运动的作用。有研究[3-4]证实ICC是胃肠道的起搏细胞,可产生自发电节律变化，沿胃肠道传递形成慢波。并且还具有传导慢波，介导肠神经信号传导等重要功能。胃肠动力障碍性疾病的发生与ICC密切相关，特别是肠道ICC细胞数量的减少或网状结构的破坏[5-7]。Gibbons等[8]证实在人类正常结肠道组织内,ICC的凋亡是一个持续动态的过程，ICC凋亡的程度反映了ICC细胞网络的更新能力。因此,延缓ICC的凋亡,维持完整的ICC细胞网络对于预防和治疗胃肠道动力障碍性疾病有重要意义。本实验初步探讨了四磨汤对ICC体外增殖的干预作用,为四磨汤对胃肠动力障碍性疾病的临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 SD大鼠，昆明种小鼠(出生后15 d),雌雄不拘。由吉林大学实验动物中心提供。

1.1.2 试剂 M199培养基(Gibco),SCF(Sigma)，Ⅱ型胶原酶(Gibco)，胎牛血清，MTT(Sigma)，DMSO(Sigma)，Ficoll400(Sigma)。

1.2 方法

1.2.1 小肠组织单细胞悬液的制备 小鼠禁食12 h后，无菌条件下取距离回盲部10 cm的小肠，放入培养皿，剥离系膜与血管，用PBS(pH 7.0)将小肠内容物冲洗干净，将小肠用注射器针头纵行剖开，剥离黏膜层，PBS反复冲洗肌条3～4次，将肌条剪碎至1～2 mm3小块后放入烧杯中，加入 Ⅱ 型胶原酶(1.3 mg/mL)，37 ℃消化30 min。然后过200目筛网滤去大块组织，离心，1 500 r/min，3 min。去上清，用10 mL M199重悬细胞，将细胞加入等体积Ficoll400梯度密度液上，3 000 r/min离心10 min，取液面交界细胞沉淀。

1.2.2 细胞培养 用M199培养基(含M199，10%FBS，青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL、5 ng/mLSCF)，调整细胞浓度至1×106/mL,接种至6孔培养板，板中预先放置包被鼠尾胶原(2 ng/cm2)的盖玻片。放入培养箱内，在37 ℃，5%CO2条件下培养。24 h后换液，移除未贴壁细胞，加培养基继续培养，每3～4 d换液1次，倒置显微镜下观察细胞生长状况。

1.2.3 药物干预

1.2.3.1 直接给药途径 四磨汤按照中药常规煎煮方法，收集药液，反复离心除杂质取上清，于50 ℃浓缩至1 g/mL药液，倍比稀释成低剂量组(1 μg/50 μL)，中剂量组(2 μg/50 μL)，高剂量组(4 μg/50 μL)3组；过滤除菌,于-20 ℃冰箱保存。MTT法测定：调整细胞密度为1×105/mL，每孔200 μL接种于96孔板,用含15%胎牛血清的M199培养基培养细胞，待细胞汇合度达70%左右，加入无血清培养液培养24 h使细胞同步。

实验共分4组，即空白对照组；四磨汤低、中、高剂量组；每个剂量设6孔，加灭菌后的四磨汤药液干预，培养48 h，培养结束前4 h各孔加入MTT(5 g/L)20 μL，再继续孵育4 h后去上清，每孔加入DMSO100 μL，振荡混匀10 min，于酶标仪测490 nm波长处光密度(OD)值，并计算细胞增殖率。

1.2.3.2 含药血清给药途径 将大鼠随机分为对照组、四磨汤低剂量组、中剂量组、高剂量组。对照组给予等体积的生理盐水，四磨汤给药组以临床成人日用量的10倍作为中剂量，20倍和5倍分别作为高剂量和低剂量。灌胃给药连续7 d，第7天重复给药2次,间隔时间2 h，并于末次给药1 h后眼球取血，无菌条件下分离血清，置56 ℃水浴30 min灭活，再经0.2 μm滤膜过滤除菌，加入M199培养基，使之终浓度分别为：10%，20%，30%。调整细胞密度为1×105/mL，每孔200 μL接种于96孔板,用含15%胎牛血清的M199培养基培养细胞，待细胞汇合度达70%左右,加入无血清培养液培养24 h使细胞同步。

实验分空白对照组，四磨汤含药血清低、中、高剂量组；每个剂量设6孔,加含药血清干预，培养48 h，培养结束前4 h各孔加入MTT(5 g/L)20 μL，再继续孵育4 h后去上清，每孔加入DMSO100 μL，振荡混匀10 min，于酶标仪测490 nm波长处光密度(OD)值，并计算细胞增殖率。

2 结果

2.1 直接给药途径四磨汤对ICC的体外增殖干预作用 见表1。

表1 直接给药途径四磨汤对ICC的增殖作用(±s)

表1结果显示：四磨汤中、高剂量组不同程度地促进了Cajal间质细胞的增殖，其中以中剂量组促进作用最为明显，二者与空白对照组比较有显著统计学意义(P<0.01)。

2.2 含药血清给药途径四磨汤对ICC的体外增殖干预作用 见表2。

表2 含药血清给药途径四磨汤对ICC的增殖作用(±s)

表2结果显示：四磨汤含药血清组干预ICC 48 h后,其细胞增殖率与空白对照组比较有显著统计学意义(P<0.01)。其中，10%、20%浓度的含药血清的细胞增殖率显著升高，而30%浓度的含药血清细胞增殖率下降，提示不同浓度的四磨汤含药血清对ICC增殖作用强度不同;10%、20%含药血清组具有促进细胞增殖作用，30%含药血清组具有抑制ICC增殖的趋势。

3 讨论

ICC是胃肠道内一种与神经系统密切相关的特殊类型的间质细胞,是具有独立功能的特殊间质细胞,以网状结构存在于胃肠道[9]。作为胃肠道神经系统的一种非神经但又与神经密切相关的特殊间质细胞,有潜在的控制胃肠道动力的作用。ICC减少在顽固性慢传输性便秘患者结肠动力障碍的发生机制中有非常关键的作用[10]。四磨汤在临床上被广泛应用于胃肠动力障碍性疾病，具有很好的临床基础[11]，现代药理[12-14]实验也验证了其明确的促胃肠动力的作用。但目前仍不清楚究竟四磨汤通过何种途径防治胃肠功能障碍性疾病。因此，对四磨汤促胃肠动力的分子机制进行深入研究极其必要。本研究通过直接给药与含药血清给药2种途径,采用MTT法对ICC的增殖进行干预，结果显示:四磨汤在一定的给药途径和药物浓度情况下具有促进ICC增殖作用，我们分析，四磨汤在临床上被广泛应用于胃肠动力障碍性疾病的基础有可能是通过促进ICC增殖而发挥的作用,其具体的作用机制还有待于进一步研究。

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