活血消瘿方对结节性甲状腺肿模型大鼠甲状腺细胞增殖和凋亡的影响

涂晓坤，指导：陈如泉

(1.湖北中医药大学，湖北 武汉 430061；2.湖北省中医院，湖北 武汉 430061)

结节性甲状腺肿是一种常见的甲状腺病症，长期甲状腺肿最终都会发展为结节性甲状腺肿，如果用超声或手术病理检查，几乎绝大多数临床诊断的弥漫性甲状腺肿在超声检查中都被发现为结节性甲状腺肿。其在人群中的发病率为4.0%～7.0%。患者之中女性多于男性，患病率随年龄增长而增加，大多数为良性病变，恶性率低于5%[1]。目前,结节性甲状腺肿的门诊患者流量急剧增加，关于结节性甲状腺肿的临床及实验研究也日益受到重视。对于结节性甲状腺肿西医保守治疗主要选用甲状腺激素抑制性治疗，虽然能使某些甲状腺肿的弥慢性增大部分缩小但对腺体本身作用较小，而且毒副作用大，剂量不易掌握。部分病例主张早期手术切除，但手术治疗有复发率高、并发症多等缺点，病人常难以接受。中医并没有结节性甲状腺肿之病名，根据本病的主要临床表现一般将其类属于“瘿瘤”的范畴。活血消瘿方是陈如泉教授临床治疗甲状腺肿的经验方，已有临床研究[2]显示活血消瘿方治疗结节性甲状腺肿作用优于优甲乐，具有肯定的临床疗效及安全性。

1 实验材料

1.1 药品及试剂 丙基硫氧嘧啶(propylthiouracil,PTU)，深圳市中联制药有限公司生产；左旋甲状腺素片(levothyroxine，L-T4)，默克公司生产；PCNA检测试剂盒，由武汉博士德公司提供；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒，由abcam公司提供。

活血消瘿方煎煮液:该方由蜣螂虫10 g，土鳖虫10 g，蜈蚣5 g，莪术10 g，王不留行10 g，桃仁10 g，猫爪草10 g，柴胡10 g组成。以上生药均由湖北中医药大学附属医院门诊部药房提供。将上药放在干净的玻璃杯中加水500 mL浸泡30 min，然后于100 ℃煎煮至500 mL，过滤药渣后得滤液300 mL，再将药渣加入400 mL纯水继续煎至300 mL,合并2次煎煮液，分别稀释至0.264 g/mL、0.132 g/mL、0.066 g/mL。

1.2 仪器 DYY-6C电泳仪，北京市六一仪器厂；Epson Perfection V300 Photo扫描仪，Epson公司；752-P紫外可见光分光光度计，上海现科仪器有限公司。BD-FACS Calibur流式细胞仪，BD公司。

1.3 动物 健康雄性Wistar大鼠30只，体质量150 g左右，由武汉病毒研究所提供。

2 方法

2.1 分组方法 取Wistar大鼠30只，随机分成6组，每组各5只，即正常组、模型组、L-T4组、小剂量活血消瘿方组、中剂量活血消瘿方组和大剂量活血消瘿方组。

2.2 造模方法 参照Tamura的方法[3]造模。用生理盐水配成0.1%的PTU溶液,每只大鼠每天按100 mg/kg 体质量连续灌服8周。甲状腺彩超发现大鼠甲状腺肿块,即为造模成功。

2.3 处理方法 正常组灌服生理盐水，其余5组，即模型组、L-T4组、小剂量活血消瘿方组、中剂量活血消瘿方组和大剂量活血消瘿方组行造模处理。同时L-T4组大鼠每天按100 mg/kg体质量灌服L-T4。小剂量活血消瘿方组、中剂量活血消瘿方组、大剂量活血消瘿方组大鼠每天分别按0.44 g/kg体质量、0.88 g/kg 体质量、1.76 g/kg体质量灌服活血消瘿方。

2.4 取材和指标检测 于8周后处死大鼠，取大鼠双侧甲状腺，保存于-20 ℃。1)采用Western Blot法检测PCNA在大鼠甲状腺组织中的表达，结果以AlphaEase FC软件取值，计算标本灰度值；2)采用流式细胞仪Annexin V/PI双染色法检测大鼠甲状腺肿组织中的细胞凋亡水平。

3 结果

3.1 各组大鼠甲状腺组织中PCNA的表达 见表1。

表1 PCNA在大鼠甲状腺细胞中的表达(±s)

3.2 各组大鼠甲状腺细胞凋亡水平 见表2。

表2 各组大鼠甲状腺凋亡细胞比例(±s) %

4 讨论

活血消瘿方由蜣螂虫、土鳖虫、蜈蚣、莪术、王不留行、桃仁、猫爪草、柴胡等组成。蜣螂虫为方中之君药，主活血化瘀。土鳖虫具有散血瘀、消坚结、解凝活血、接骨续筋、消肿止痛、下乳通经等功效。蜈蚣具有熄风止痉，解毒散结，通络止痛的作用。土鳖虫、蜈蚣2味，共达活血消瘿之效，为方中臣药。因搜剔经络之风、湿、痰、瘀，莫如虫类，络道疏通，气血畅流，顽痹方能缓解，处方中用虫药以达逐风、活血、化瘀、祛痰之目的。莪术功效行气破血、消积止痛。王不留行功效活血通经、下乳消肿、利水通淋。桃仁功效活血祛瘀、润肠通便。猫爪草具有清热解毒、软坚化痰、散结消肿等多方面的功效。莪术、桃仁、王不留行、猫爪草配伍，共化瘿病之痰血瘀阻，为方中佐药。柴胡功效解表退热、截疟、疏肝解郁、升举阳气，为方中使药。全方药物配伍共奏活血化痰、消瘿化结之效。

结节性甲状腺肿的发病机制尚不清楚，目前认为[4]可能与甲状腺细胞的增殖和凋亡失去平衡有关。目前己发现有多种评价细胞增殖的方法，其中PCNA是最常用的指标之一。PCNA是一种分子量为36 KD的蛋白质,在细胞核内合成，并存在于细胞核内，为脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)聚合酶6的辅助蛋白，由于其在DNA复制和修复中的重要功能，已广泛作为反映细胞增殖的重要指标[5]。在细胞核内存在可溶性与不溶性2种PCNA,可溶性PCNA在细胞周期各期中均有表达,其量在DNA合成过程中不发生明显变化,易被去污剂提取、甲醇破坏；不溶性PCNA较稳定，不易被去污剂洗脱、甲醇破坏，这种PCNA在G0-G1期细胞中无明显表达,G1晚期，其表达大幅度增加,S期达到高峰，G2-M期明显下降，其量的变化与DNA合成一致，一般作为评价细胞增殖状态的一个指标[6]。临床研究[7]已经证明PCNA的表达在甲状腺肿组织中显著增强。在实验性大鼠甲状腺肿模型中，PCNA较正常对照组相比，表达明显增强，在撤掉致甲状腺肿因素后，随着甲状腺重量的减轻，PCNA的表达也逐渐减弱[8]，此结果与本实验相符。

细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。细胞发生凋亡时，膜上的磷脂酰丝氨酸外露早于DNA断裂发生，因此Annexin V联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。另外，Annexin V联合PI染色不需固定细胞，可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此，Annexin V联合PI法更加省时，结果更为可靠，是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。结果与细胞凋亡的关系尚未明了。赵明等[9]的研究发现与正常甲状腺滤泡细胞相比，非毒性结节性甲状腺肿甲状腺滤泡细胞含有较多的凋亡小体，两者有显著性差异，提示非毒性结节性甲状腺肿的发病机理和甲状腺滤泡细胞的凋亡有密切的关系，也与本实验的结果相符。

[1]连小兰.美国《甲状腺结节和分化型甲状腺癌诊治指南(2006)》解读[J].中国实用外科杂志,2007,27(12):933.

[2]吴淑琼,左新河,陈如泉,等.活血消瘿片治疗结节性甲状腺肿的临床价值[J].武汉大学学报(医学版),2010,31(3):394.

[3]TAMURA M,KIMURA H,KOJI T,et al.Role of apoptosis of thyrocytes in a rat model of goiter,A possible involvement of Fas system[J].Endocrinology,1998,139(8):3646-3653.

[4]MEZOSI E,YAMAZAKI H,BRETZ J D,et al.Aberrant apoptosis in thyroid epithelial cells from goiter nodules[J].Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism,2002,87(9):4264-4272.

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[9]赵明,杜宏,王坚,等.非毒性结节性甲状腺肿与细胞凋亡关系的探讨[J].天津医药,2001,29(9):553-554.