梓葛冻干粉针剂对人脐静脉内皮细胞体外缺血再灌注模型损伤的保护作用

张聪聪 ，马 强 ，薛 强 ，陈 刚 ，徐晓玉

（1.西南大学药学院重庆市药效评价工程技术研究中心，重庆400716；2.重庆工商大学药物研究中心，重庆400067）

梓葛冻干粉针剂为本实验室创制的治疗脑缺血损伤的中药复方新药，主要由梓醇和葛根素组成。其处方思路基于脑缺血疾病的复杂性，针对多靶点、多途径治疗入手，选择各有效成分进行联合应用，其处方与制备工艺已经申报国家技术发明专利。课题组既往研究显示，梓醇能够促进离体培养的原代皮质神经元轴突生长［1］，促进脑缺血大鼠缺血周围区皮质血管新生，同时改善脑血管内皮细胞肿胀［2-3］，并能显著改善局灶性永久性脑缺血大鼠神经功能［4］。葛根素具有神经保护作用［5］，减轻大鼠脑缺血再灌注损伤，改善神经行为活动［6］。上述结果提示，将中药单体梓醇和葛根素组方可能成为治疗脑血管疾病的候选药物。近年研究发现，器官缺氧-复氧损伤时血管内皮细胞稳态所起的主要作用和人脐静脉内皮细胞与人体生理的相似性和可获得性，本研究采用体外培养人脐静脉内皮细胞，以缺氧-复氧的方式模拟整体水平的缺血再灌注损伤，观察中药单体组方梓葛冻干粉针剂对人脐静脉内皮细胞缺氧-复氧模型损伤的保护作用，为其用于脑缺血再灌注损伤的临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验试剂 梓葛冻干粉针剂由西南大学中药研究所研制提供，主要成分为梓醇和葛根素，批号：20100512；DMEM培养基购自Gibco公司；Hyclone血清购自北京赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司，批号：NVM0347；Bcl-2、Bax，Caspase-3，GAPDH，β-actin 抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；ECL化学发光试剂和PVDF膜购自 Millipore公司；一氧化氮（NO）测试盒，批号：20100902，丙二醛（MDA）试剂盒，批号：20100728，超氧物歧化酶（SOD）试剂盒，批号：20100728，乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒，批号：20100312，均购自南京建成生物工程研究所；胰蛋白酶（Trypsin），四氮唑蓝（MTT）购自美国Sigma公司。尼莫地平购自德国拜耳医药保健有限公司，批号：J20100002；其余试剂如二甲基亚砜（DMSO）、盐酸等均为进口分装或市售分析纯。

1.1.2 实验仪器 CO2培养箱（美国NACPO6000）；电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统（Bio-Rad）；紫外分光光度计（日立高新 U-3010）；纯水系统（Millipore）；高速冷冻离心机（Eppendorf 5417R）；超低温冰箱（Thermo）；倒置显微镜（德国 Ziss IX71），酶标仪（美国 BioTek Elx800），缺氧装置乃本实验室自制。

1.2 实验方法

1.2.1 体外缺血再灌注模型的建立 模型以1997年Danica Stanimirovic D等［7］报告的方法加以改进。人脐静脉内皮细胞株（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs，购于中国科学院上海细胞生物学研究所）常规培养48 h后，弃掉培养基，用D-Hanks液冲洗2次，将所有孔换成无血清缺氧培养液（Krebs液），放入经95%N2、5%CO2的混合气饱和的密闭自制缺氧容器中，37℃培养4 h，然后取出培养板，将缺氧培养液换成25 mL/L胎牛血清DMEM后于37℃、5%CO2条件下复氧培养2 h。

1.2.2 分组及给药 正常组：细胞在37℃、5%CO2条件下培养；模型组：细胞在给予上述缺氧处理4 h后再于37℃、5%CO2条件下培养2 h；尼莫地平组在复氧时加入2.1 mg/L的尼莫地平，梓葛低（12.5 mg/L）、中（24.5 mg/L）、高（49.0 mg/L）剂量组，复氧时分别加入相应剂量的梓葛冻干粉针剂，其余过程同模型组。

梓葛冻干粉针剂和尼莫地平均以生理盐水溶解，分别按12.5 mg/L、24.5 mg/L及49.0 mg/L和2.1 mg/L加入培养基中。在复氧时，各给药1次。同时正常组和模型组给予相同体积的生理盐水。每组均设复孔6个。

1.2.3 人脐静脉内皮细胞活力的测定 采用MTT法。吸弃培养基，PBS洗3次，96孔板每孔加入5 g/L的MTT溶液各15 μL，于培养箱中37℃、5%CO2条件下孵育4 h后，弃去MTT液，每孔加入100 μL的DMSO，振荡器轻轻混匀10min后，以酶标仪，490 nm波长，检测A值。

1.2.4 NO、MDA含量和SOD活力的测定 复氧2 h后，弃去培养基，用PBS洗涤2次。加入300 μL细胞裂解液于冰上裂解30 min后，高速冷冻离心机离心10 min，取100 μL细胞上清液测定按试剂盒说明书操作，用硫代巴比妥酸显色法、硝酸还原酶法和黄嘌呤氧化酶法分别测定细胞MDA、NO含量和SOD活力。

1.2.5 LDH释放量的测定 复氧2 h后，取细胞培养上清，按试剂盒说明操作，用2，4-二硝基苯肼显色法测定LDH释放量。

1.2.6 蛋白提取及浓度测定 参照文献［8］方法，将收集的细胞离心沉淀，吸干水分后，加入150 μL冰冷的细胞裂解液于冰上匀浆，冰浴30 min；4℃下12000 rpm，离心10min；取上清（含胞膜和胞浆裂解物）置于4℃预冷的Ep管中，液氮速冻，-70℃保存备用。用考马斯亮蓝法测定总蛋白浓度。

1.2.7 Western blot检测 取裂解液上清，分别加入5倍上样缓冲液于沸水浴中加热5 min后离心，加入已灌制好的10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离目的蛋白，每泳道上样40μg；电泳结束，将分离蛋白转印至PVDF膜；TBST洗膜，随后将膜置于5%脱脂奶粉封闭液中，室温封闭1 h，然后用一抗工作液孵育，4℃过夜（16 h～18 h）；TBST充分洗膜后，用HRP标记二抗工作液37℃孵膜；TBST洗膜，将膜移入ECL工作液中，显影，压片，用Quantity one 4.5.1版图像分析软件（Bio-Rad公司产品）分析条带的光密度值，以目标蛋白与内参条带比值作为目标蛋白相对表达量，试验重复3次。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 梓葛冻干粉针剂对缺氧-复氧损伤人脐静脉内皮细胞活力、MDA、NO含量、LDH释放量和SOD活性的影响

结果见表1。由表1可见，与正常组相比，模型组A值、SOD活性显著性降低（P<0.05）；MDA和NO含量以及LDH释放量均显著性升高（P<0.05）。与模型组比较，梓葛低剂量组A值显著高于模型组（P<0.05）；梓葛低、中剂量组MDA和LDH含量显著降低（P<0.05）；梓葛低剂量组NO含量显著降低（P<0.05）；梓葛冻干粉针剂的各剂量组SOD活性均显著提高（P<0.05）。

表1 梓葛冻干粉针剂对缺氧-复氧损伤HUVECs的MDA、NO含量和SOD、LDH活性及细胞活力的影响 （±s）

表1 梓葛冻干粉针剂对缺氧-复氧损伤HUVECs的MDA、NO含量和SOD、LDH活性及细胞活力的影响 （±s）

注：与正常组比较，1）P<0.05；与模型组比较，2）P<0.05

LDH（U/g）正常组 - 1.14±0.56 0.18±0.06 5.35±0.82 14.18±0.79 4.85±0.46模型组 - 0.68±0.161） 0.41±0.061） 12.12±0.781） 8.75±0.851） 11.25±1.141）尼莫地平组 2.1 0.88±0.122） 0.23±0.082） 7.82±0.792） 14.95±0.932） 5.89±0.402）梓葛低剂量组 12.5 0.87±0.342） 0.26±0.092） 8.16±0.362） 12.88±1.022） 6.11±1.282）梓葛中剂量组 24.5 0.79±0.28 0.31±0.122） 10.08±0.80 12.50±0.782） 8.45±0.862）梓葛高剂量组 49.0 0.75±0.29 0.36±0.11 12.03±0.97 10.98±0.862） 9.49±0.95组别 剂量（mg/L）MTT（A）MDA（mmol/g）NO（mmol/g）SOD（U/mL）

2.2 梓葛对缺氧-复氧损伤人脐静脉内皮细胞损伤相关凋亡蛋白表达的影响

结果见表2、图1。

表2 梓葛冻干粉针剂对缺氧-复氧损伤HUVECs的Bcl-2、Bax、caspase-3 蛋白表达的影响 （±s）

表2 梓葛冻干粉针剂对缺氧-复氧损伤HUVECs的Bcl-2、Bax、caspase-3 蛋白表达的影响 （±s）

注：与正常组比较，1）P<0.01；与模型组比较，2）P<0.05，3）P<0.01

组别 剂量（mg/L） caspase-3 Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax正常组 - 0.35±0.01 0.89±0.03 0.22±0.01 4.05±0.20模型组 - 0.56±0.021） 0.60±0.061） 0.44±0.021） 1.37±0.131）尼莫地平组 2.1 0.40±0.013） 0.74±0.033） 0.29±0.013） 2.53±0.093）梓葛低剂量组 12.5 0.55±0.01 0.69±0.052） 0.40±0.003） 1.75±0.123）梓葛中剂量组 24.5 0.42±0.013） 0.70±0.023） 0.33±0.013） 2.16±0.123）梓葛高剂量组 49.0 0.44±0.023） 0.67±0.03 0.41±0.012） 1.61±0.072）

由表2、图1可以看出，与正常组比较，模型组caspase-3和Bax蛋白表达显著升高，Bcl-2蛋白表达显著下降，Bcl-2/Bax显著降低（P<0.01）；与模型组比较，梓葛中、高剂量组caspase-3蛋白表达水平显著降低（P<0.01）；梓葛低、中剂量组Bcl-2蛋白表达水平显著升高（P<0.05，P<0.01）；梓葛各剂量组Bax蛋白水平显著降低（P<0.05，P<0.01）；同时梓葛各剂量组Bcl-2/Bax均显著提高（P<0.05，P<0.01）。

3 讨论

本实验研制的梓葛冻干粉针剂在于提供一种治疗脑缺血性疾病的中药有效成分复方药物制剂，组方依据源于《千金方》羌活汤（羌活、葛根、芍药、桂心、麻黄、生地黄、甘草、生姜）治疗中风。《神农本草经》也提到地黄能“除痹”，葛根能治“诸痹”，葛根因具有升腾发散之性，能窜达上下，故使气血通畅，脉络得开。故葛根与地黄配伍，一内一外，相辅相成，可针对中风、痹证进行治疗。

依据机体内皮细胞缺血-再灌注损伤过程中组织间液的变化，包括缺氧、乳酸堆积、酸中毒和糖耗竭等，本实验采用Krebs液制备细胞损伤模型，模拟整体动物的缺血-再灌注损伤过程。

近年研究发现，梓醇能够阻止线粒体膜电位的丧失，提高内源性抗氧化能力，降低自由基生成，从而抑制由1-甲基-4-苯基吡啶离子介导的多巴胺神经元损伤［9］。葛根素对小鼠的缺氧损伤具有显著延长存活时间的作用，以及对小鼠缺氧后再暴露所引起的脂质代谢产物丙二醛的产生也有显著的抑制作用［10］。实验中缺氧-复氧后，LDH释放量显著增加，A值降低，显示细胞出现严重的损伤，细胞的存活率降低；同时细胞MDA和NO含量升高，SOD活性显著下降，表明自由基大量产生与缺氧-复氧损伤有关。给予梓葛冻干粉针剂后，梓葛冻干粉针剂组LDH释放量、MDA和NO含量显著降低，细胞活力提高，SOD活性显著提高，表明梓葛冻干粉针剂可提高细胞抗氧化的能力，抵抗人脐静脉内皮细胞缺氧-复氧损伤过程中的氧化损伤，对缺氧-复氧损伤的人脐静脉内皮细胞具有直接的保护作用。

Anuradha C等［11］发现抗氧化剂的保护作用是通过维护线粒体跨膜压、拮抗caspase-3激活和上调Bcl-2实现的。相关研究表明，葛根素能通过降低caspase-3蛋白的表达水平，增强Bcl-2蛋白表达水平［12］，上调细胞凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax的比值等［13］，实现对缺血性脑损伤的神经保护作用。本实验中，药物干预后，梓葛冻干粉针剂显著提高人脐静脉内皮细胞Bcl-2蛋白的表达，降低Bax和caspase-3蛋白的表达，并上调Bcl-2/Bax比值。表明梓葛冻干粉针剂可能通过上调Bcl-2蛋白和下调Bax蛋白的表达，上调Bcl-2/Bax，阻断caspase-3的激活，从而对缺血再灌注所造成的损伤起到一定的保护作用。

综上所述，本研究发现梓葛冻干粉针剂可调控人脐静脉内皮细胞抗氧化和凋亡相关蛋白的表达，对缺氧-复氧损伤有明显的保护作用。其机制可能通过抑制细胞自由基的产生、提高抗氧化能力、调控Bcl-2家族成员、升高Bcl-2/Bax、拮抗Caspase-3的激活，抑制细胞凋亡，对缺血再灌注损伤起到保护作用。本研究首次报道梓醇、葛根素配伍合用对人脐静脉内皮细胞缺氧-复氧模拟的体内缺血再灌注损伤模型的保护作用，对于更多更确切的保护机制将是课题组进一步探究的内容。

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