补肾、健脾和补肾健脾方对尾部悬吊大鼠腰椎骨丢失的作用研究

张 林，范 颖，陈文娜，李 然 ，孙宏伟，马贤德

（1.辽宁中医药大学基础医学院方剂学科，辽宁沈阳110032；2.辽宁中医药大学教学实验中心，辽宁沈阳110032）

大量研究表明，航天员在进入太空失重环境飞行过程中，骨质丢失是一种必然发生的病理改变［1-2］。至今，尚未研究出对抗这种骨丢失安全有效的措施。近年来，祖国医学在此方面多采用以补肾为主的方药进行干预，取得了良好效果。然而中医认为“肾主骨，脾主四肢”、“脾主运化，充养肾精，精生髓，髓养骨”。脾和肾对机体骨量维持恒定均具有重要作用，因此本研究在建立大鼠尾部悬吊模拟失重骨丢失模型的基础上，着重探讨补肾、健脾和补肾健脾三方对模拟失重腰椎骨丢失的防护作用，比较其异同，力求获得有效的防护方药。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠60只，级别SPF/VAF，体重（180±10）g，北京维通利华实验动物中心提供。许可证号：SCXK（京）2006-0009。

1.1.2 实验药物 补肾方（BSD）：由鹿茸、淫羊藿等组成，健脾方：由生晒参、生黄芪等组成，补肾健脾方：由生晒参、

生黄芪、鹿茸、淫羊藿等组成，全部药材购自北京同仁堂辽宁有限责任公司。补肾方和补肾健脾方中鹿茸打碎，过100目筛兑入药液，三个方中其余药物均采用常规水煎煮法提取，补肾方、健脾方和补肾健脾方将所得全部药液混合依次浓缩成0.42 g原药材/mL、0.56 g原药材/mL、1 g原药材/mL浓度备用。

1.1.3 实验仪器 双能X线骨密度分析仪：美国，Lunar；DMLA显微照相系统：德国，Leica；硬组织切片机：德国，Leica。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与给药 60只大鼠随机分为：正常组（C）、悬吊组（S）、补肾组（SD）、健脾组（PD）和补肾健脾组（SPD）5组，每组12只。依据人和动物间体表面积折算的等效剂量比值表计算大鼠给药剂量，SD、PD、SPD组大鼠从实验第1天开始依次按2.4 g/（kg·d）、3.2 g/（kg·d）、5.7 g/（kg·d）给予补肾方、健脾方和补肾健脾方灌胃。其余各组大鼠灌服等容积的生理盐水。S组、SD组、PD组、SPD组大鼠采用头低位-30°尾部悬吊法［3］模拟失重，每天悬吊 24 h，共悬吊 21d；C组大鼠不采取任何处理。实验第21天，各组大鼠称重，于灌胃后2 h脱颈椎处死，取第4腰椎（L4）。

1.2.2 指标测定

1.2.2.1 腰椎重量测定 除净附在第4腰椎上的肌肉和软组织，在分析天平上称量重量，计算大鼠L4椎体占体重比（mg/g）。1.2.2.2 骨密度测定 每组中随机选取6只大鼠的L4椎体，生理盐水冲洗，用双能X线骨密度分析仪测定大鼠离体L4椎体的骨密度，以单位面积的骨矿物质含量（g/cm2）表示骨密度值。

1.2.2.3 骨形态计量学参数测定 每组中剩余6只大鼠的L4椎体，用10%中性甲醛固定，70%～95%酒精梯度脱水，塑料液浸泡，塑料包埋，用硬组织切片机切片，厚度30 μm，丽春红三色染色，用全自动显微镜在50倍视野下进行图像采集，取切片中心部的5个视野测量并取其平均数，Image Pro Plus6.0软件测量骨小梁面积比（Tb.Ar）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁分离度（Tb.Sp）。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 补肾、健脾、补肾健脾三方对模拟失重大鼠L4椎体重量的作用

结果见表1。

表1 补肾、健脾、补肾健脾三方对模拟失重大鼠L4椎体重量的作用 （±s）

表1 补肾、健脾、补肾健脾三方对模拟失重大鼠L4椎体重量的作用 （±s）

注：与正常组比较，1）P<0.01；与悬吊组比较，2）P<0.01；与补肾健脾组比较，3）P<0.05

组别正常组（C）悬吊组（S）补肾组（SD）健脾组（PD）补肾健脾组（SPD）n 12121212 12 L4重/体重（mg/g）1.307±0.0331.168±0.0431）1.251±0.0472）1.221 ±0.0542）3）1.266±0.0492）

由表1可以看出，与C组比较，S组大鼠L4椎体重/体重明显降低（P<0.01）；与 S组比较，SD、PD、SPD 组大鼠 L4椎体重/体重均明显升高（P<0.01）；与SPD组比较，PD组大鼠 L4椎体重/体重降低（P<0.05）。

2.2 补肾、健脾、补肾健脾三方对模拟失重大鼠L4椎体骨密度的作用

结果见表2。

表2 补肾、健脾、补肾健脾三方对模拟失重大鼠L4椎骨密度的作用 （±s）

表2 补肾、健脾、补肾健脾三方对模拟失重大鼠L4椎骨密度的作用 （±s）

注：与正常组比较，1）P<0.01；与悬吊组比较，2）P<0.05，3）P<0.01；与补肾健脾组比较，4）P<0.05，5）P<0.01

组别 n 骨密度（g/cm2）正常组（C） 6 0.106±0.007悬吊组（S） 6 0.083±0.0031）补肾组（SD） 6 0.093±0.0043）4）健脾组（PD） 6 0.090±0.0082）5）补肾健脾组（SPD） 6 0.100±0.0073）

由表2可以看出，与C组比较，S组大鼠L4椎体骨密度明显降低（P<0.01）；与S组比较，SD、SPD组大鼠L4椎体骨密度明显升高（P<0.01），PD组大鼠L4椎体骨密度升高（P<0.05）；与SPD组比较，PD组大鼠L4椎体骨密度明显降低（P<0.01）、SD 组降低（P<0.05）。

2.3 补肾、健脾、补肾健脾三方对模拟失重大鼠L4椎体骨形态计量学参数的作用

结果见表3和图1。

表3 补肾、健脾、补肾健脾三方对模拟失重大鼠L4椎体骨形态计量学参数的作用 （±s）

表3 补肾、健脾、补肾健脾三方对模拟失重大鼠L4椎体骨形态计量学参数的作用 （±s）

注：与正常组比较，1）P<0.01；与悬吊组比较，2）P<0.05，3）P<0.01；与补肾健脾组比较，4）P<0.05，5）P<0.01

组别nTb.Ar（%）Tb.Th（μm）Tb.N（mm）Tb.Sp（μm）正常组（C） 642.55±6.36 54.34±5.92 4.11±0.3093.52±8.86悬吊组（S） 621.49±5.191） 33.19±3.391） 2.89±0.501）132.07±9.501）补肾组（SD） 632.59±5.033）4）43.50±5.653）4） 3.54±0.353） 115.23±10.993）4）健脾组（PD） 631.44±4.643）4）41.86±4.643）5） 3.44±0.392） 117.39±9.732）4）补肾健脾组（SPD） 639.11±4.673） 49.85±3.333） 3.81±0.413）103.37±9.553）

由表3可以看出，与C组比较，S组大鼠L4椎体Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N 均显著降低（P<0.01），Tb.Sp显著升高（P<0.01）；与 S 组比较，SD、SPD 组大鼠 L4椎体 Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N均显著升高（P<0.01），Tb.Sp明显降低（P<0.01），PD 组大鼠L4椎体 Tb.Ar、Tb.Th明显升高（P<0.01），Tb.N 增加、Tb.Sp降低（P<0.05）；与SPD组比较，SD和PD组大鼠L4椎体Tb.Ar下降（P<0.05），SD组大鼠L4椎体Tb.Th降低、Tb.Sp升高（P<0.05），PD组大鼠L4椎体Tb.Th明显降低（P<0.01），Tb.Sp 升高（P<0.05）。

3 讨论

实践证明，人类在进入太空失重环境后，会出现骨质丢失，导致骨密度下降和骨质疏松。太空飞行一个月导致骨密度下降约1%～1.5%，这些骨质丢失主要发生于某些特定部位，如腰椎、股骨颈、股骨大转子和骨盆，其程度较绝经期骨质疏松更为严重［4］。为了提高航天员飞行中的工作能力和返回地面后的再适应能力，必须采取有效的防护措施。本研究所采用的大鼠尾部悬吊模型，是目前国内外公认的研究模拟失重常用的地面动物模型［3］。实验结果显示，大鼠尾部悬吊21 d L4椎体骨密度显著下降，骨形态计量学静态参数改变：骨小梁面积百分率、骨小梁厚度、骨小梁数量明显降低，骨小梁分离度明显增高，L4椎体与体重之比也明显下降，与以往的研究结果一致［5］，表明大鼠尾部悬吊21 d出现了明显的骨质疏松。

失重引起的骨丢失是古代中医学从未涉及的病症，是现代人在探索未知世界面临的一项亟待解决的医学课题。但是中医学对“骨”的生理有相关记载，如“肾主骨，脾主四肢”、“脾主运化，充养肾精，精生髓，髓养骨”。因此对失重性骨丢失可以采取补肾方药、健脾方药或者补肾健脾方药进行防治。目前的研究主要集中在对单纯补肾和以补肾为主结合健脾、活血法组方的两大类方剂的防治效用方面［6-8］，尚未有关于补肾、健脾、补肾健脾方药的比较研究。本次实验发现，补肾、健脾、补肾健脾三种方药均在不同程度上升高模拟失重大鼠L4椎体骨密度、L4椎体与体重比，增加L4椎体骨小梁面积百分率、骨小梁厚度、骨小梁数量，降低骨小梁分离度。韩艳等［9］的研究结果也显示益肾中药复方能显著改善尾部悬吊大鼠股骨直径和密度，与本次研究部分结果一致。本实验还发现，在三种方药中，补肾健脾方药的作用与补肾方药和健脾方药存在差异，其对失重性骨丢失的防护作用为最优，而补肾方药与健脾方药之间比较差异无统意义，提示健脾方药可以用于失重性骨丢失的防治，而且对补肾方药的防治疗效具有协同促进作用。

［1］Smith S M，Wastney M E，O’Brien K O，et al.Bone markers，calcium metabolism，and calcium kinetics during extended-duration space flight on the Mir space station［J］.J Bone Miner Res，2005，20（2）：208-218.

［2］Sibonga J D，Cavanagh P R，Lang T F，et al.Adaptation of the skeletal system during long-duration spaceflight［J］.Clinic Rev Bone Miner Metabol，2008，5（4）：249-261.

［3］Morey-Holton E R，Globus R K.Hindlimb unloading rodent model：technical aspects［J］.J Appl Physiol，2002，92（4）：1367-1377.

［4］Globus R K，Morey-Holton E R.Advances in understanding the skeletal biology of spaceflight［J］.Gravitational and Space Biology，2009，22（2）：3-12.

［5］Tavella S，Ruggiu A，Giuliani A，et al.Bone turnover in wild type and pleiotrophin-transgenic mice housed for three months in the international space station（ISS）［J］.Plos One，2012，7（3）：1-14.

［6］傅骞，胡素敏，周鹏，等.尾部悬吊3周及中药干预对模拟失重大鼠全身骨密度的影响［J］.中国中医药信息杂志，2010，17（1）：28-30.

［7］邹本贵，刘宏奇.健脾中药对骨质疏松症大鼠骨组织形态的改善作用［J］.山西中医学院学报，2009，10（1）：11-13.

［8］马永洁，万玉民，谢力勤，等.复方活血补肾中药对尾悬吊大鼠骨质量的影响［J］.中国临床康复，2006，10（3）：133-135.

［9］韩艳，覃华，刘新友，等.益肾中药复方对模拟失重大鼠股骨生物力学特性的影响［J］.第四军医大学学报，2007，28（11）：1018-1020.