扶正化瘀法调控脂联素对非酒精性脂肪性肝病脂质代谢的影响

王雨秾，吴春岚，孙敏梓

（上海中医药大学，上海201203）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是遗传-环境-代谢相关性疾病，包括单纯性脂肪肝及由其进展而来的脂肪性肝炎和脂肪性肝硬化。NAFLD的发病机制尚不明确，但较为公认的机制为以氧化应激和脂质过氧化为轴心的“二次打击学说”，认为初次打击主要为胰岛素抵抗（insulin resistant，IR），二次打击主要为反应性氧化代谢产物增多，导致脂质过氧化，进而引起脂肪变性的肝细胞发生炎症、坏死甚至纤维化。IR贯穿NAFLD发病始终，是造成NAFLD脂质代谢紊乱的关键。同时发现，脂联素具有增加胰岛素敏感性、抗炎、增加葡萄糖摄取、促进脂肪酸氧化等作用，并且可以介导肝内脂肪变化。因此，通过调控脂联素水平来改善IR，正成为调节NAFLD脂质代谢水平的新切入点。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 Wister雄性大鼠60只体重170 g左右，来源于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，生产许可号：SCXK（沪）2008-0016。

1.1.2 实验药物 人参皂苷Re，批号：0609，7000 mg，纯度：90%，吉林大学有机教研室；丹参酮IIA标准品1200mg，纯度：98%，上海顺勃生物技术有限公司；辛伐他汀，批号：09475，规格：20 mg/片×6盒，杭州默沙东制药有限公司。

1.1.3 高脂饲料的配方 本课题采用Professor Edward W.Kraegen实验室长期运用的大鼠高脂饲料诱导胰岛素抵抗，该饲料中含有脂肪59%，碳水化合物20%，蛋白质21%，其余如纤维、维生素、微量元素等的含量与正常饲料相同。

1.1.4 主要试剂 脂联素试剂盒T228-10，Groundwork Biotechnology Diagnosticate Ltd.；血糖试纸 ACCU－CHEK，生化试剂，罗氏诊断有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型的诱导和给药方法 Wister大鼠雄性60只，随机分成正常组、高脂组、Re组、Re+丹参酮ⅡA组、丹参酮ⅡA组、对照组6组，每组10只，笼养 1 w，以适应环境。第2周开始，除正常组外，每组用高脂饲料喂养，自由取食，每只每天18 g，每天给饲料前称量大鼠体重，记录。同时，称量大鼠吃剩的饲料，记录。喂养2 w后，开始对高脂饲料喂养大鼠进行药物干预，即：对照组予辛伐他汀7 mg/（kg·d），人参皂苷Re组予Re 50 mg/（kg·d），丹参酮ⅡA组予丹参酮IIA 5 mg/（kg·d），Re+丹参酮IIA组分别予Re 50 mg/（kg·d）+丹参酮IIA 5 mg/（kg·d），连续灌胃4 w、给药期间，各组仍予高脂饲料喂养，自由取食，每天称量体重，记录。喂养4 w后采集动物血清、皮下脂肪、肝脏、下肢肌肉组织各一份，-70℃保存。

1.2.2 检测指标

1.2.2.1 血清胆固醇、甘油三酯、游离脂肪酸检测 所有动物血清标本经离心机离心，转速4000转/min，时间4 min，抽取上层血清，采用全自动生化仪检测甘油三酯（TG）、胆固醇（CHOL）、游离脂肪酸（FFA）含量。

1.2.2.2 血清脂联素检测 采用ELISA法测定血清脂联素（ADP）浓度。实验操作完全按试剂盒指示操作。

1.3 统计学方法

采用SPSS17.0软件进行统计分析。所有计量资料采用（±s）进行描述，各组间采用方差分析。

2 结果

2.1 各组大鼠喂养前后的体重变化比较结果见表1。

表1 各组大鼠喂养前后体重变化 （g，±s）

表1 各组大鼠喂养前后体重变化 （g，±s）

组别 n 喂养前体重 喂养后体重 体重增加量正常组 10 142.64±5.20 269.09±16.77 126.45±17.15高脂组 10 144.83±2.14 285.33±17.48 140.50±16.69 Re 组 10 140.00±5.33 277.17±18.55 137.17±20.54 Re+丹参酮IIA 组 10 142.50±2.88 278.33±28.42 135.83±26.16丹参酮 IIA 组 10 141.00±6.39 275.67±26.20 134.67±22.88对照组 10 140.5±5.50 262.17±8.66 121.67±8.55

由表1可以看出，各组间体重增量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），各用药组均较高脂组体重增加缓慢，中药有延缓大鼠体重增加的趋势，但其体重增量仍高于辛伐他汀给药组，提示中药对IR抵抗的大鼠体重的影响不及西药辛伐他汀明显。

2.2 各组大鼠血清甘油三酯（TG）与血清胆固醇（CHOL）含量比较

结果见表2。由表2可以看出，与对照组比较，Re组、Re+丹参酮IIA组甘油三酯（TG）、胆固醇（CHOL）含量降低，差异有统计学意义（P<0.05）；Re+丹参酮IIA联合用药降低CHOL作用在各药物干预组中最明显，优于西药辛伐他汀。2.3 各组大鼠血清游离脂肪酸（FFA）与血清脂联素（ADP）含量比较结果见表3。

表2 各组大鼠血清甘油三酯与血清胆固醇含量比较 （mmol/L，±s）

表2 各组大鼠血清甘油三酯与血清胆固醇含量比较 （mmol/L，±s）

注：与正常组比较，1）P<0.05；与对照组比较，2）P<0.05

组别 n 甘油三酯（TG） 胆固醇（CHOL）正常组 10 0.39±0.112） 0.87±0.122）高脂组 10 0.49±0.14 1.04±0.12 Re 组 10 0.45±0.192） 1.09±0.261）Re+丹参酮ⅡA组 10 0.44±0.102） 1.02±0.29丹参酮ⅡA组 10 0.56±0.111） 1.05±0.15对照组 10 0.64±0.281） 1.18±0.161）

表3 各组大鼠血清游离脂肪酸与血清脂联素含量比较 （±s）

表3 各组大鼠血清游离脂肪酸与血清脂联素含量比较 （±s）

组别 n FFA（mmol/L） ADP（ng/mL）正常组 10 0.58±0.09 2.11±0.28高脂组 10 0.50±0.26 2.02±0.39 Re组 10 0.63±0.38 1.87±0.19 Re+丹参酮IIA组 10 0.57±0.11 2.06±0.27丹参酮 IIA 组 10 0.72±0.28 1.88±0.22对照组 10 0.65±0.36 1.91±0.24

由表3可以看出，各组间两两比较，FFA差异无统计学意义（P＞0.05）。但结合各组均值比较发现，各药物干预组较高脂组FFA均呈现上升趋势，提示药物干预有促进脂肪代谢的作用。同时发现，Re组FFA水平接近西药对照组，Re+丹参酮IIA组FFA水平接近正常组，提示Re单独或联合用药均具有促进脂肪代谢的作用，且联合用药可起到协同作用，促进脂肪分解趋势更显著。ADP在各组间两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）。Re组、丹参酮IIA组ADP水平接近对照组水平，而Re+丹参酮IIA组ADP水平接近正常组，优于其他组，提示Re+丹参酮IIA联合用药对改善高脂饮食诱导的IR模型的ADP水平有一定作用。

3 讨论

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的代谢应激性肝损伤，目前认为脂代谢异常（尤其是 TG）与胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）所引发的高游离脂肪酸（FFA）、高胰岛素血症是NAFLD发病机制的中心环节。NAFLD根据其在肝脏组织中的脂肪变程度和炎症情况，可从单纯性脂肪肝进展成非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH），并进而进展到肝硬化［1］，并且通过加剧胰岛素抵抗而诱发动脉粥样硬化性心脑血管疾病的发生。

脂联素是由Scherer P E等［2］首次发现脂肪特异性分泌蛋白具有调节免疫和机体代谢的双重作用，在免疫调节的同时，通过内分泌、旁分泌、自分泌的方式调节机体代谢。目前研究发现的两种脂联素受体，脂联素受体1（AdipoR1）主要在骨骼肌中表达，脂联素受体2（AdipoR2）主要在肝脏表达。脂联素须与其相应受体结合后，通过激活AMP活化的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）［3］及有丝分裂原活化蛋白激酶P38（P38 mitogen-activated protein kinase，P38MAPK）两个途径，引起下游一系列信号分子的改变，使乙酰辅酶A羧化酶（ACC）和过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferators-activated receptorα，PPARα）磷酸化［4］，通过影响胰岛素分泌、调节脂类氧化葡萄糖摄取、抑制巨噬细胞转化，从而发挥降糖、降脂，改善IR等生物学作用［5-6］；并通过影响肝脏脂肪代谢、周围组织对胰岛素的敏感性、炎症因子产生等阻断对肝脏的“初次打击”和“二次打击”，从而抑制NAFLD的形成和进展。

人参皂苷Re能起到自由基陷阱作用，可以保护所有的未饱和脂肪酸，阻止其被氧化；且对小鼠的体液免疫和细胞免疫均有刺激作用，增强免疫功能。研究发现，人参皂苷Re在2型糖尿病鼠模型中具有显著的抗高血糖活性，其可以显著改善葡萄糖耐量，同时可显著降低血清胰岛素水平、体重、摄食量和血胆固醇水平，并增加能量消耗和胰岛素引起的糖分配［7］。进一步研究发现，人参皂苷Re可起到“类胰岛素”的作用，并从更深层次上解释了人参皂苷Re的降糖机制［8］。丹参酮ⅡA可有效地清除氧自由基［9］，并可使血浆中总胆固醇、甘油三酯［10］和低密度脂蛋白的含量降低，高密度脂蛋白的水平升高，从而起到降血脂的作用［11］。

本实验发现，FFA浓度伴随ADP水平提高呈下降趋势，同时血清TG、CHOL随之也呈现不同程度的下降趋势。其机制可能与胰岛素介导的葡萄糖利用率下降以及脂质氧化率增高和游离脂肪酸水平降低有关。与目前研究提示ADP的激活代谢过程相符合。

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