芽孢杆菌诱变育种研究进展

杨丽丽，尹宝华，侯文菊，石慧清

（山西舜天农业微生物科学技术研究院，山西阳泉045000）

芽孢杆菌（Bacillus）是一类好氧或兼性厌氧、在一定条件下能产生抗逆性内生孢子的有机化能异养菌。它们在自然界分布非常广泛，生理特性丰富多样，主要存在于土壤、植物体表面及水体中，由于它们能够产生对热、紫外线、电磁辐射和某些化学药品有很强抗性的芽孢，能忍受多种不良环境[1]，因此，芽孢杆菌在医学、农业、工业和环境污染治理等领域被广泛应用。

微生物菌种在自然条件下发生突变的概率较低，且突变幅度也不大，基因结构一般很难发生改变。因此，单纯依赖微生物群体的自然突变来选育特异性菌株远不能满足生产和研究需要。随着生命科学的发展以及学科交叉的深入，诱变育种技术得到不断发展和创新，从而为筛选更多高效菌种提供了技术上的可能和便利。

诱变育种是以诱变剂诱发基因突变，通过筛选突变体，寻找正向突变菌株的一种诱变方法[1]。该技术突变率高，在较短时间内能获得更多的优良变异类型，且诱变手段多样、操作简便。因此，是实验室研究及工业生产中最常采用的优良菌株选育方式。目前，物理诱变、化学诱变和生物诱变是3种常见的诱变方法。目前，国内还未见有关芽孢杆菌的综述性研究报道。

本文综述了国内近年来应用于芽孢杆菌的诱变育种技术，旨在为芽孢杆菌高效诱变育种提供理论依据。

1 物理诱变育种

目前，发现的主要物理诱变方法有X射线、紫外线、γ射线、α射线、β射线、中子、超声波、激光、宇宙射线和离子辐照诱变育种等[2-3]。

1.1 紫外线诱变技术

紫外线诱变技术是诱变和筛选优良菌株的常规育种方法。紫外线专一性作用于嘧啶，主要使相邻的嘧啶碱基尤其是胸腺嘧啶之间发生共价结合，形成的嘧啶二聚体会阻碍碱基间的正常配对，导致突变甚至死亡[4]。因紫外诱变技术具有设备简单、诱变效率高、操作安全简便等优点而被广泛应用。

因菌种差异，紫外线对各种微生物的诱变效应截然不同。通常情况下，经紫外照射3～5 min即可使微生物营养体致死，但芽孢杆菌较特殊，约需10 min。另外，可见光修复是微生物紫外诱变后不容忽视的问题。一般为降低可见光的修复率，可在诱变后冰浴2 h或暗培养1 d。利用紫外诱变已选育出了大量优良微生物菌种[5]。

高淑红等[6]用紫外诱变育种方法，由枯草芽孢杆菌D-2诱变得到遗传稳定性良好的莽草酸缺陷型突变株D-202。其在2 t发酵罐中发酵单位可达到50 g/L。肖湘政等[7]用紫外线诱变胶质芽孢杆菌HM8841，诱变出了发酵周期短、抗逆性强的菌株。王洲等[8]采用紫外线对产α-ALDC的枯草芽孢杆菌进行诱变，得到2株比原菌株酶活分别提高107.62%和162.25%的菌株。张智等[9]对枯草芽孢杆菌Ls-02进行紫外诱变，选育出1株遗传性稳定的枯草芽孢杆菌Ls-02-45。

1.2 激光诱变技术

激光因具有操作简单、安全、变异率高、辐射损伤轻等特点，在工业微生物育种中得到广泛应用[2]。生物有机体直接或间接地受到激光辐射产生的光、热、压力和电磁场效应综合作用的影响，引起了细胞染色体畸变、酶的激活或钝化、细胞分裂和细胞代谢活动的改变。细胞内含物中的任何物质一旦发生改变，都可能导致生物有机体在细胞学和遗传学特性上发生变异[4]。同种生物有机体被不同种类激光辐射后，会表现出不同的细胞学和遗传学变化，这为生物诱变育种提供了有利条件[5]。黄建新等[10]发现，He-Ne激光对产α-乙酸乳酸脱羧酶的地衣芽孢杆菌具有明显的诱变作用，在合适的照射剂量下，使其产酶能力比原菌株提高了2倍以上。

1.3 微波诱变技术

微波是一种具有波动性和高频性的电磁波[5]，它与生物组织的相互作用主要表现为热效应和非热效应，能刺激水、蛋白质、核酸、脂肪和碳水化合物等极性分子快速振动。这种振动引起的摩擦能够对氢键、疏水键和范德华力产生作用，使DNA结构发生变化，导致遗传变异。微波诱变设备简单、方法易行、操作安全，诱变效果比传统的诱变方法好，在工业微生物菌种选育中具有较大的应用价值。颜贤仔等[11]研究表明，通过微波诱变技术对产淀粉酶的枯草芽孢杆菌7658进行诱变，可以有效改善其产淀粉酶的能力。

1.4 γ射线诱变技术

γ射线高能量产生的电离作用，可直接氧化脱氧核糖的碱基或脱氧核糖的化学键，间接使水或有机分子产生自由基，导致DNA损伤，造成基因突变，还可引起染色体断裂、倒位、缺失和易位等畸变，从而改变微生物遗传性状[4]。该诱变技术不但能获得高突变率和宽突变谱，而且还有利于新突变型的筛选。但γ射线有一定的局限性，操作要求较高，且有一定的危险性，通常在不能使用其他诱变剂进行诱变育种时才使用。索晨等[12]利用60Coγ射线对1株产γ-聚谷氨酸的地衣芽孢杆菌进行诱变，筛选得到1株高产突变株Bacillus licheniformis S16。

1.5 离子注入诱变技术

离子注入诱变技术具有高线性能量转换值、集束性好、射程可控等优点，因此，其具有突变率较高、突变谱广、死亡率低、正突变率高、性状稳定等特点，是一种很有潜力的诱变选育新方法。近几年，离子注入诱变技术发展非常迅速，应用普及较快，尤其在微生物改良、选育优良工业微生物菌株方面不仅带来可观的经济效益，而且带来巨大的社会效益。陈志谊等[13]利用不同剂量N+对枯草芽孢杆菌生防菌B-916进行离子注入处理，获得了拮抗能力比原菌株提高10%以上，且遗传性较稳定的突变菌株。

2 化学诱变育种

化学诱变是指利用一些化学物质提高生物的自然突变率。化学诱变具有突变率高，位点特异性强；对处理材料损伤轻，染色体畸变比例少，极少有致死型发生；价格便宜，操作简单，不需要特殊设备等特点。烷化剂是芽孢杆菌诱变育种中最常使用的诱变剂[5]。烷化剂具有一个或多个易取代DNA分子中活泼氢原子的活性烷基，能够烷化DNA分子上的碱基及部分磷酸，使得DNA复制时常发生碱基配对错误而引起突变[2]。常用的烷化剂有亚硝基胍、乙基硫酸甲烷、硫酸二乙酯、乙烯亚胺等。有研究表明，对多黏类芽孢杆菌进行亚硝基胍诱变后，获得比原菌株提高106%发酵单位的菌株[14]。孙金凤等[15]用1株壳聚糖酶活较高的芽孢杆菌菌株，经硫酸二乙酯（DES）诱变处理50 min后，筛选得到壳聚糖酶活明显提高的突变株DES-4，其壳聚糖酶活为26.7 nkat/mL，是原菌株的2.7倍。

3 生物诱变育种

目前，按诱变方式可将生物诱变剂分为3大类：转导诱发突变、转化诱发突变和转座诱发突变[2]。其中，应用最广泛的是转座诱发突变。王玉飞等[16]用含转座子Tn917的质粒pLTV3转化炭疽杆菌，对2 000个突变体进行了筛选，从中得到6株芽孢形成缺陷型突变株。

4 复合诱变育种

微生物突变机制复杂，单一诱变往往难以达到预期目的。因此，诱变育种往往采用组合2种或2种以上化学或其他诱变剂的育种方法，即复合诱变，其具有协同效应。2种或多种诱变剂的先后使用、同一种诱变剂的重复作用、2种或多种诱变剂的同时使用都较单一诱变效果好[17]。尹明浩等[18]采用紫外-硫酸二乙酯复合诱变的方法，选育出1株高产3-羟基丁酮的枯草芽孢杆菌。张敏等[19]对枯草芽孢杆菌515菌株进行紫外线、氯化锂、硫酸二乙酯的复合诱变，获得了1株遗传稳定性高的产几丁质酶的活性菌株。李欣等[20]利用紫外线照射和快中子辐射相结合的方法，对地衣芽孢杆菌进行诱变，获得1株摇瓶效价较原菌株提高23%的突变株B-55。

5 小结与展望

综上所述，关于芽孢杆菌诱变育种的方法多种多样，但具体的芽孢杆菌诱变育种还存在不少问题。由于单一的手段往往难以诱变得到活性较高的菌株，在生产中就要运用各种复合诱变技术对其诱变，以获得优良菌种。

随着经济的发展、科研水平的提高，芽孢杆菌与人们的日常生活更为密切，它作为一种十分重要的工业微生物菌种，越来越引起人们的普遍关注和青睐。目前，芽孢杆菌在农作物病害防治、饲料加工、环境治理等方面的研究还处于起步阶段，具有广阔的发展前景。随着现代生物技术的不断发展以及对诱变育种技术的深入研究，把分子生物学技术应用于芽孢杆菌的研究，也将成为热点。芽孢杆菌诱变育种丰富和拓宽了菌种的变异类型，尤其是自然界少有的性状变异，增加了可利用的基因资源，也使诱变筛选效率得到进一步提高。

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