剑门火腿菌相构成及主要腐败菌特性分析

李欣蔚，迟原龙，贾冬英，黄 灏，姚 开*

（1.四川大学 轻纺与食品学院，四川 成都 610065；2.成都大学 师范学院，四川 成都 610106）

剑门火腿是以猪后腿为原料在自然或人工控温条件下进行腌制和长时间发酵而成的具有特殊风味、色泽与质地的肉制品，是烹调美味佳肴的上乘原料，但其在贮藏过程中微生物会继续生长繁殖，从而导致其腐败变质。国内外对发酵肉制品中微生物的种群及其变化已进行了较多研究，李平兰等[1]发现宣威火腿中的主要优势菌是葡萄球菌、微球菌和霉菌，且表层数量明显多于内部；甄宗园等[2]对金华火腿发酵过程中微生物区系的研究显示，葡萄球菌和乳酸菌是火腿内部的优势菌；PAARUPT等[3]研究认为，微球菌是西班牙干腌火腿中数量最多的微生物。基于原料、工艺和环境等不同因素会影响发酵火腿中微生物的组成和比例，加之目前有关剑门火腿的微生物特性研究尚无报道，因此对剑门火腿的菌相构成及其主要腐败菌的特性进行了分析，其研究结果可为传统发酵火腿的防腐保质提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

剑门火腿由四川剑阁某火腿厂提供；MSA培养基、MRS培养基、VRBDA培养基、孟加拉红培养基为北京奥博星生物技术公司提供，生理生化鉴定所用培养基（氧化酶、接触酶、葡萄糖发酵、蛋白酶、脂肪酶、耐酸、耐盐、耐亚硝酸盐、产粘、产酸、产氨、产气、产H2S）的制备方法见参考文献[4]；其他均为分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

仪器UV-2000型紫外可见分光光度计，PHS-2C型酸度计等。

1.3 方法

1.3.1 火腿的菌相分析

剔除火腿表面氧化层，分别随机取火腿表层及其2.0cm以下的肌肉组织，取剪碎后混合的适量样品，加入定量的无菌生理盐水，匀浆后进行梯度稀释。取适当稀释度的菌悬液，分别接入不同选择性培养基中于适宜条件下进行培养，其中MSA培养基、MRS培养基、VRBDA培养基于37℃培养48h，孟加拉红培养基于28℃培养96h。对不同选择性培养基中的典型菌落进行计数（平行重复3次，取其平均值）、分离纯化、形态及生理生化特征检测。

1.3.2 菌株耐盐性测定

将分离得到的细菌菌株分别接种于NaCl浓度为9.0%、12%、15%（w/v）的MSA和MRS液体培养基中，37℃培养24h，测其OD600值，以未接菌株的培养基作为空白对照。

1.3.3 菌株耐亚硝酸盐性测定

将分离得到的细菌菌株分别接种于含有150mg/kg NaNO2的MSA和MRS液体培养基中，37℃培养24h，测其OD600值，以未接菌株的培养基作为空白对照。

1.3.4 菌株耐酸性测定

将分离得到的葡萄球菌和微球菌分别接种于pH值为4.5的MSA液体培养基中，37℃培养24h，测其OD600值，以未接菌株的培养基作为空白对照。

1.3.5 菌株产粘能力测定

将分离得到的细菌菌株分别接种于MSA和MRS固体培养基，37℃培养24h，接种环挑取菌落判断其粘性。

1.3.6 菌株产酸能力测定

将分离得到的细菌菌株分别接种于MSA和MRS液体培养基，37℃培养24h，测定其pH值，以未接菌株的培养基作为空白对照。

1.3.7 菌株产氨能力测定

将分离得到的细菌菌株分别接种于产氨培养基中，37℃培养24h，滴加3～5滴氨试剂，观察沉淀生成情况，产生黄色或棕红色沉淀者为阳性，否则为阴性。

1.3.8 菌株产气能力测定

将分离得到的细菌菌株分别接种于葡萄糖发酵培养基中，37℃培养24h，杜氏小管内有气泡产生者为阳性，否则为阴性。

1.3.9 菌株产H2S能力测定

将分离得到的细菌菌株分别穿刺接种于H2S培养基中，37℃培养2d，沿穿刺线产生黑色沉淀的为阳性，否则为阴性。

1.3.10 菌株蛋白酶活力测定

将分离得到的细菌菌株分别接种于MSA和MRS液体培养基中，37℃培养24h。取0.1mL菌液涂布于酪蛋白培养基上，37℃培养5d，于菌落周围滴加10%（v/v）三氯乙酸，观察菌落周围是否出现透明圈并测其直径d（d<0.1cm为产酶能力弱，d：0.1cm～0.5cm为产酶能力中等，d>0.5cm为产酶能力强）。

1.3.11 菌株脂肪酶活力测定

将分离得到的细菌菌株分别接种于MSA和MRS液体培养基中，37℃培养24h。取0.1mL菌液涂布于猪背脂培养基上，37℃培养5d，观察菌落周围是否出现透明圈并测其直径d。

2 结果与分析

2.1 剑门火腿的菌相构成

分别对MSA和MRS培养基上的典型菌落进行分离和纯化，依据BROWN MH等[5]推荐的肉品中微生物的鉴定程序对其进行生理生化检测，并对孟加拉红培养基上的典型菌株进行菌落形态和个体形态的观察。结果显示，由MSA培养基分离出3株葡萄球菌（S-1、S-2和S-3）和1株微球菌（C-1），由MRS培养基分离出2株乳酸菌（L-1和L-2），由孟加拉红培养基分离出2株霉菌（M-1和M-2）和2株酵母菌（Y-1和Y-2）。

剑门火腿表面和内部肌肉组织中的菌相构成如图1所示。可以看出，火腿中微生物主要由葡萄球菌、微球菌和酵母菌构成，且表层数量明显多于内部。火腿中霉菌主要分布于其表面，且数量较少（仅为70cfu/g），结果与宣威火腿中的霉菌数量相差较大[1]，这可能与火腿表面氧化层已剔除有关；火腿表层的细菌主要为葡萄球菌和微球菌，而内部主要由葡萄球菌和乳酸菌构成，该结果与李平兰等[1]和甄宗圆[2]的研究结论相一致，这是由于火腿表面的高盐环境抑制了某些乳酸菌的生长，而火腿内部致密的组织和无氧的环境不利于微球菌生长的缘故；酵母菌在剑门火腿中也占有一定的比例；剑门火腿中基本无肠杆菌检出，这是由于火腿中的高盐量（8.5%～9.0%）抑制了肠道菌的生长，或葡萄球菌和乳酸菌对肠杆菌具有一定的限制作用[3]。

图1 剑门火腿的菌相构成Fig.1 Microflora composition in Jianmen ham

2.2 剑门火腿中菌株的耐盐性

剑门火腿中葡萄球菌、微球菌及乳酸菌于不同NaCl浓度下的生长量见表1。可以看出，菌株的生长量随NaCl浓度的增加而降低；3种菌在9.0%NaCl下均有一定生长，但在17%NaCl下仅有葡萄球菌S-1和微球菌C-1生长，且菌株C-1的OD600值仅为0.026，表明其生长很弱。由于剑门火腿的含盐量为8.5%～9.0%，故在此条件下3种菌都能正常生长，其中葡萄球菌S-1的耐盐能力最强。

表1 不同NaCl 浓度时菌株的吸光值Table 1 OD600of strains in different concentrations of NaCl

2.3 剑门火腿中菌株的耐亚硝酸盐能力

剑门火腿中葡萄球菌、微球菌及乳酸菌在NaNO2浓度为150mg/kg下的生长量见表2。可以看出，6株菌均具有一定的亚硝酸盐耐受性，其中葡萄球菌（S-1、S-2和S-3）对亚硝酸盐具有较强的耐受性，而微球菌C-1和乳酸菌（L-1和L-2）对亚硝酸盐的耐受性相对较弱。

表2 含亚硝酸盐培养液中菌株的吸光值Table 2 OD600of strains in nitrite-containing media

2.4 剑门火腿中菌株的耐酸能力

剑门火腿中葡萄球菌及微球菌于pH值为4.5培养液中的生长量见表3。可以看出，葡萄球菌均具有一定的耐酸性，其中菌株S-1的耐酸性最强；微球菌C-1的耐酸性较差。

表3 pH4.5 培养液中菌株的吸光值Table 3 OD600of strains in pH 4.5 media

2.5 剑门火腿中菌株的致腐特性

剑门火腿中葡萄球菌、微球菌及乳酸菌的致腐特性见表4。可以看出，葡萄球菌和微球菌均不产粘、不产氨、不产气、不产H2S，且产酸能力较弱；葡萄球菌S-3可产蛋白酶，而菌株S-1和S-2及C-1均不产生蛋白酶；葡萄球菌和微球菌都具有产脂肪酶的能力，其中菌株S-2和S-3及C-1具有中等的产脂肪酶能力，这与刘晓强[4]对云南火腿中葡萄球菌和微球菌的主要特性分析结果基本相同。

表4 剑门火腿中主要细菌的致腐特性Table 4 Spoilage capabilities of main bacteria in Jianmen ham

乳酸菌L-1不产粘，而菌株L-2具有产粘特性；菌株L-1和L-2均不产氨、不产气、不产H2S，但产酸能力均较强；菌株L-2具有一定的产蛋白酶能力；2株乳酸菌均具有一定产脂肪酶能力，其中菌株L-2的产脂肪酶能力更强。微生物产粘可能是其分解蛋白质的缘故，不仅破坏肉品的内部组织，而且影响产品外观，进而造成其腐败变质；而脂肪在微生物产生的脂肪酶作用下发生水解，也会加速肉品的酸败变质。此外，乳酸菌在同型发酵过程中产生的有机酸降低了环境的pH值，使肉品发生腐败而产生酸味[6]。

综上所述，可以认为剑门火腿中的葡萄球菌S-3及乳酸菌L-2是导致其腐败的主要微生物。

3 结论

剑门火腿的菌相是由种类不同的微生物所构成。其中，葡萄球菌、微球菌和酵母菌的数量占优，且表层数量明显高于其肌肉组织内部；乳酸菌主要分布于火腿内部，霉菌主要存在于火腿表层。主要细菌的致腐特性分析结果显示，葡萄球菌S-3和乳酸菌L-2是导致剑门火腿腐败的主要菌株。

[1]李平兰，沈清武，吕燕妮，等.宣威火腿成熟产品中主要微生物菌相构成分析[J].中国微生态学杂志，2003，15（5）：262-263.

[2]甄宗圆.金华火腿微生物区系研究[D].重庆：西南农业大学硕士学位论文，2004.

[3]PAARUP T,NIETO JC,PELAEZ C,et al.Microbiological and physico-chemical characterization of deep spoilage in Spanish dry-cured hams and characterization of isolatedEnterobacteriaceaewith regard to salt and temperature tolerance[J].Eur Food Res Technol，1999，209（5）：366-371.

[4]刘晓强.云南火腿中菌种的分离筛选及在发酵火腿中的应用[D].长春：吉林农业大学硕士学位论文，2008.

[5]BROWNMH.Meat Microbiology[M].New York:Applied Science Publishers LTD，1982：474-475.

[6]张春江，王海燕，罗 欣.微生物引起的肉与肉制品的腐败[J].微生物与食品，2001（6）：16-19.