DNA-PKcs的研究进展

蔡 昱综述 翟建军审校

DNA-蛋白激酶 (catalytic sunbunit of the DNA-dependent protein kinase，DNA-PKcs)是DNA依赖蛋白酶 (DNA-dependent protein kinase，DNA-PK)的催化亚单位，属于PI3K家族，主要从事双链DNA断裂修复，在细胞的凋亡和防止肿瘤形成及肿瘤的耐药、耐辐射中起着作用。我们对DNA-PKcs的结构功能、作用机制及在肿瘤中的作用作一探讨。现将其综述如下。

1 DNA-PKcs的结构及功能

DNA-PKcs也称为DNA活化蛋白酶，是1个460～470 kD丝氨酸苏氨酸酶，属于1种肿瘤抑癌基因的看家基因[1]。DNA-PKcs作为1个具有催化活性的次单元体与1个具有结合DNA能力而调控其激活性的次单元体Ku共同组成DNA-PK[2]。DNA-PKcs同共济失调毛细血管扩张突变基因(ataxia telangiectasia,mutated,ATM)和Rad3相关蛋白 (ATM-andRad3-related,ATR) 激酶均属于PI3K家族[3]。最近几年的研究，发现DNA-PKcs主要从事双股DNA断裂(DNA Double -Strand Break;DSBs)的非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)的修复和产生抗体多样性V(D)J重组及复制调节。除此之外，DNA-PKcs在基因的转录调控、核染色质及端粒结构的维持、T淋巴细胞及B淋巴细胞的发育中也具有相当重要的作用。如果没有基因重排,B细胞就不能成熟，因为B细胞所携带的抗体是由V(D)J区的特定组合和连接过程中所附加的核酸所决定的[4～9]。

2 DNA-Pkcs作用机制

2.1 在NHEJ和V(D)J 重组中的作用

生物体本身基因的完整性容易受一些外在环境因素影响，辐射线的伤害或是一些化学试剂的破坏都会造成DNA的双股链断裂(double-strand break，DSBs)，DSBs也会在免疫球蛋白的位置特一性V(D)J 重组过程中产生。DNA的DSBs无法修补或是不正确的修补都将使染色体产生变异，从而导致细胞的癌变或是死亡。因此，对真核细胞来说DSBs的修补与维持保有基因的完整性是非常重要的，其中最主要的修补机制就是NHEJ。这种修复机制的特性是2个重组DNA分子并不需要互补的DNA序列。NHEJ的修补成员有DNA-PKcs、Ku、DNA连接酶(DNA-ligase)Ⅳ和XRCC4 蛋白等，其中以DNA-PKcs为主要作用。NHEJ在免疫细胞的分化和发育上，在抗体多样性的V(D)J 重组作用方面亦扮演尤为重要的角色。NHEJ经由V(D)J 重组可产生多样性的抗体和T细胞接受子以认识及对抗外来的抗原[9～11]。

所谓的V(D)J 重组是由任一V (Variable)基因片段和任一的D (Diversity) 或J (Joining)基因的片段随意连接在一起以解释成可认识抗原的功能区。简单来说，V(D)J 重组作用可分成2个阶段，第一、2个淋巴细胞特有的蛋白质，RAG1 和RAG2 (重组活化基因)认识RSS (重组信号序列)于V ，D 和J 基因两侧，进行双股DNA断裂(DSB)，产生开始信号端(Signal ends)和发夹状带码端(Hairpined coding ends)。第二、经由NHEJ 的作用，开始信号端和发夹状带码端分别连接在一起。目前已知参与连接的蛋白质和NHEJ 的DNA DSB 修复为相同的蛋白质，有4个重要的互补分布群组在NHEJ 中扮演重要的角色，分別是XRCC4,XRCC5,XRCC6 及 XRCC7 。XRCC4与DNA 连接酶Ⅳ共存在同一多蛋白质复合体中，XRCC4 可以增加DNA连接酶Ⅳ的活性。而XRCC5,XRCC6 及XRCC7 则分別代表Ku80,Ku70及DNA-PKcs的基因。因此，DNA-PK在NHEJ中也扮演着尤为重要的角色[12，13]。

2.2 调控机制

2.2.1 Ku对DNA-PKcs的调控作用 Ku蛋白是DNA结合蛋白，是Ku70/Ku80异源二聚体，这个复合体能补充、活化DNA依赖激酶催化亚单位(DNA-PKcs)共同组成DNA依赖激酶(DNA-PK) 。Ku是1个功能保守的端粒蛋白，它从啤酒酵母到人都十分保守，紧密结合于双链DNA的突出端或平末端。Ku同DNA-PKcs一起，参与由非同源末端融合导致的DNA链断裂和V(D)J重组中DNA链的修复，也可能通过进化保守机制同时参与端粒的复制和染色体的末端保护。一般认为DNA-PK的活化模式是透过Ku 的作用。Ku 可以结合到受损双股DNA 的断裂处，似乎Ku可以辨认DNA的DSBs，结合在DNA的Ku 经由其立体结构的变异，促使DNA-PKcs 在DNA/Ku 的复合体上组合，以形成1个具有反应活性的多蛋白质复合体 DNA/Ku/DNA-PKcs 。此反应复合体可以促使 NHEJ 成员的组合或是会影响到一些参与NHEJ 因子的活性。此种方式，一方面可以防止受损DNA 的末端继续受到其他核酸酶的作用，另一方面Ku/ DNA-PKcs 可以增加DNA 连接酶的活性，促使受损DNA 的末端相互连接。这证明Ku蛋白和DNA-PKcs在维持人体正常免疫功能，调节DNA修复，防止细胞恶变方面有很重要的作用[9，14]。

2.2.2 其他因素对DNA -PKcs磷酸化的调控 DNA-PK 在DSB 的修补与V(D)J 的重组中是扮演着重要的角色，而DNA-PK的活性也会受到DNA-PKcs磷酸化的调控。DNA-PKcs 的自我磷酸化会使其与Ku 分开而抑制 DNA-PK 的催化活性；另外就是依赖白血病病毒(c-Abl)对DNA-PK 的调控模式，活化的c-Abl 会使DNA-PKcs 磷酸化，促使DNA-PKcs/Ku 复合体的分开而抑制 DNA-PK 的催化活性。此外，在细胞的凋亡过程中，DNA-PKcs 会被Caspase-3 所分解而丧失激酶活性；PKC δ 也会抑制DNA-PK 的激酶活性[15，16]。

2.3 DNA-Pkcs与端粒的关系

端粒，线性染色体的自然末端，包含非编码的富鸟苷酸的重复序列，并终止于1个富鸟苷酸单链突出端。它的2个特征—序列和结构—提供了1个末端处蛋白作用的平台，从而形成了1个保护性的“帽”，使得端粒免于象别的DNA双链一样断裂，如降解或非同源重组；且在维持遗传的稳定性和阻止癌变中也起着重要的作用。已有研究发现DNA-PKcs在端粒的帽子形成、维持端粒长度及稳定性中起着作用。端粒酶缺陷的人体细胞中DNA-PKcs的丢失可加速端粒的降解及细胞凋亡，或染色体不稳定性增加，最终导致癌症。可见DNA-PKcs在癌症和老化中起着关键作用[9，10]。

3 DNA-PKcs在肿瘤中的作用

机体受内外环境因素的影响，发生不同类型的DNA损伤,但是机体具有多种修复系统修复损伤,恢复DNA结构和功能。如果DNA-PKcs(机体最主要的修复系统组成部分DNA-PK的核心成员)丢失DNA修复缺陷,表现出基因组不稳定性，就会导致一些细胞生长调控基因等的失活,从而促使细胞的恶性转化[5]。

从癌变细胞的细胞核型分析结果可以看出,癌变细胞普遍存在染色体缺失现象,恶性转化细胞的DNA断裂修复能力明显降低。通过基因芯片,分子杂交等分析,发现恶性转化细胞或转化早期阶段部分DNA修复基因的表达发生明显改变,如XRCC-2,XRCC-3和Ku80(XRCC-5)的mRNA表达下调,但发现其中属于PI3K激酶家族成员的修复基因DNA-PKcs在细胞的恶性转化早期阶段受到抑制,恶性转化后表达又上升[1，17，18]。

目前有人用免疫组化法检测肝胆肿瘤组织和部分癌旁组织中催化亚基DNA-PKcs蛋白的表达情况。结果发现DNA-PKcs表达在不同类型肿瘤间存在明显差异。肝细胞癌、胆管腺癌和胆囊腺癌的DNA-PKcs阳性表达率依次降低，而乳头状腺瘤或胆管腺瘤则不表达或弱表达。侵袭性腺瘤(癌)组织表达水平显著高于非侵袭性腺瘤(癌)。癌旁组织相对低表达DNA-PKcs。表明DNA-PKcs表达水平与肿瘤类型、恶性程度、转移或侵袭性有关，有可能成为肝胆肿瘤的1个新的生物标志物[19]。但是有研究发现结肠上皮中DNA-PKcs看家基因受一些因素破坏，容易发生结肠癌[20]；还发现SCID小鼠易患T细胞淋巴瘤[2]，且胸腺细胞受电离辐射激活p53诱导细胞凋亡，但并不能阻断细胞周期[21]；因此对于DNA-PKcs是致癌还是抑癌作用尚待进一步研究。

许多动物及细胞的模式实验，已显示出SCID(Severe combined immunodeficiency)小鼠有DNA-PKcs 基因的突变，造成其对辐射线的高度敏感性与V(D) J 重组的严重缺陷[4，22]。SCID小鼠非小细胞肺癌(NSCLC)中DNA-PKcs的高表达致使DNA损伤修复系统活性增高，这是NSCLC放疗抗拒性的重要原因[23]，可能由于正常情况下DNA-PK基因修复受损的基因，癌细胞也利用DNA-PK基因来修复由抗癌治疗引起的损伤，使得肿瘤对治疗产生抵抗。

总之，DNA-PKcs作为人体修复系统的重要组成部分DNA-PK的核心成员，主要从事DSBs的修复，在端粒及染色体结构的维持、细胞的凋亡、抑制肿瘤方面有着重要的作用。

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