酪蛋白胶束结构研究方法综述

史 莹，杨 敏，梁 琪，* ，乔海军，张卫兵

(1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070;2.甘肃农业大学理学院，甘肃兰州730070;3.甘肃省功能乳品工程实验室，甘肃兰州730070)

牛乳蛋白质通常分为酪蛋白(casein，CN)和乳清蛋白，各自含量约占乳中总蛋白的80%和20%，依品种不同有变化;酪蛋白是乳中一大类蛋白质的总称，是乳中主要的蛋白质成分，由 αs1-、αs2-、β-、κ-CN四部分组成，质量比大约为 4∶1∶4∶1 左右，平均等电点在4.8;四种单体可以通过在水相中疏水作用和静电排斥作用的平衡形成CN胶束［1-2］。常乳中大约80%～95%的CN以胶体分散粒子的形式存在，称为胶束，其中包含94%的蛋白质干基和6%的胶体磷酸钙［3］。CN被广泛用在食品、化妆品和一些其他的日常用品中，因此CN胶束的性质和结构被大量研究。扫描电镜、透射电镜、电泳、反相高效液相色谱、动态光散射、超声波光谱、紫外-可见分光光度计等技术广泛用于CN胶束结构的研究中。

1 酪蛋白胶束结构的研究方法

1.1 内部结构

CN胶束的内部结构至今无法观察，许多学者提出了各种理论模型，以下三种模型被广泛接受:亚单元模型，该模型认为，15～20个CN单体分子通过疏水相互作用组成一个个亚单元，根据κ-CN的含量又分为富含和少量的κ-CN亚单元，亚单元和磷酸钙连接形成 CN胶束;内部结构模型，认为 αs1-、αs2-、β-CN位于胶束的核心，κ-CN位于胶束的表面，起保护作用;微簇结构模型，认为CN分子与磷酸钙缠绕在一起，磷酸钙分布在胶粒的内部，κ-CN在胶束表面形成毛发层结构为胶束提供静电相互作用或电荷，维持CN粒子的稳定性［4-7］。微簇结构模型在2003年提出后被广泛接受。

1.2 表面结构研究方法

CN胶束表面接近球形并且不光滑，在亚结构之间存在间隙［5］。胶束表面κ-CN的分布不均匀，从表面突起并自然延伸，直径大约在50～600nm，平均直径在150nm［8］。对CN胶束表面结构的研究主要通过扫描电子显微镜、透射电子显微镜和原子力显微镜。

1.2.1 扫描电子显微镜(scanning electron microscopy，SEM)近年来，扫描电子显微镜观察CN胶束的表观结构已经被广泛应用，工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品的表面结构有关。该手段能观察CN胶束不光滑的表面并且能测定粒径的大小。通过电子显微镜观察CN胶束的形状是球形，直径在50～500nm之间［3］。

普通的SEM分辨率比较低，不能清楚地描述表面结构，观察到的CN胶束是球形。而近几年通过高分辨率的扫描电镜观察到是近球形，比普通胶束更大，直径在300～350nm之间，CN胶束的表面比简单的由相对较短的毛发覆盖的硬球体更加复杂。CN胶束结构比简单的球形模型有更多的“面”，表面相当不规则，表面积比球形大。一些κ-CN只是管状模型的终止，不需要均匀的覆盖“球形的”表面，更接近CN的真实表面结构［9］。

1.2.2 透射电子显微镜(transmissionelectron microscopy，TEM)透射电子显微镜的原理:由电子枪发射出来的电子束，在真空通道中通过聚光镜将之汇聚成一束光斑，照射在样品上，电子束携带样品的内部结构信息，在荧光屏上成像。在低分辨率时不能提供有关结构的信息，因此一些学者用冷冻透射电子显微镜(cryo-TEM)和高分辨率的TEM观察CN胶束的结构，成功地观察到了脱脂乳的CN胶束结构，发现CN胶束的表面结构有点粗糙并且不规则，胶束的形状没有出现完全的球形［10］，并且有一个相当不规则的外围结构，从表面上看，CN被组织成蛋白质链相互纠缠的网络结构，内部结构自然的延伸并在表面突出［11］。通过高分辨率的TEM观察CN胶束的结构，McMahon［12］等人提出了CN胶束的超分子结构，尽管在CN胶束内部允许相当大的变化，但其仍是一个非常开放的结构，通过磷酸钙纳米簇上的蛋白质链的环环相扣来自我强化;在超分子矩阵结构内闭合的空间将由牛乳中溶解的乳糖、离子和其他可溶性物质的乳清占据。由此可见，高分辨率和冷冻的TEM能够成功的观察CN胶束的表面结构，且两者都被许多学者广泛应用。

1.2.3 原子力显微镜(atomic force microscopy，AFM)原子力显微镜有一根纳米级的探针，通过检测样品与探针之间的原子排斥力来反映样品表面形貌和其他表面结构，可以分辨出极小尺度上的表面细节和特征。通过该手段观察发现，牛乳CN在高压下，原始胶束的直径减小，解离程度大于聚集程度［13］。在高压下，CN表面形态相当不均匀，复合物易碎，胶束连续不断的分解，最终完全分解成单体［14］。

目前，酪蛋白胶束表面结构常用的观测手段为上述三种电子显微镜。SEM和TEM的前处理比较复杂，容易破坏CN胶束的结构;TEM对待测样品有厚度和形态上的要求，并且要求在电子线照射下不损坏或发生变化;AFM避免了复杂的前处理以及电子束辐射损伤等的限制，具有很高的横向分辨率和纵向分辨率［15］。将AFM和其他仪器结合起来，相互取长补短，在未来将会有更好的应用前景。

2 酪蛋白胶束解离与聚集的测定方法

在酶、热和高压等各种外界因素的作用下，CN胶束的稳定性会发生变化。这些变化包括酶凝过程中的解离和聚集，蛋白质水解、絮凝、凝胶作用和脱水收缩作用等［16］。酶促反应过程中κ-CN的Met106键首先会发生水解，使CN胶束发生解离，生成两种多肽:一种是N-末端的para-κ-CN，仍然和CN胶束连接着，而C-末端的多肽(糖巨肽)，被释放到乳清相中［17］。这些变化都可通过电泳、反相-高效液相色谱、超声波光谱、扩散波光谱、动态光散射、粒度仪和紫外分光光度计测定。这些方法又可分为直观的测定和通过样品溶液的理化指标来测定两种，其中电泳和反相高效液相色谱法可直观测得CN胶束的解离;而其他几种方法是通过测定溶液的指标来说明胶束的解离与聚集。

2.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)

聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。蛋白质是两性电解质，组成CN胶束的单体分子量和电荷不同，根据解离程度，溶液中的单体含量在改变，电泳可分析这四种单体的变化，因此可将其分离。十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和光密度计连接后，可成功分析凝乳酶作用脱脂乳过程中κ-CN的水解，κ-CN的水解和para-κ-CN的合成是同时进行的，两者之间的关系呈线性负相关［17］。这些结果表明SDS-PAGE能用来检测酶解脱脂乳中的κ-CN。采用Urea-PAGE分析发现，CN的水解过程中，γ-CN、β-CN的水解产物增加。研究表明，CN被水解成各个单体:γ1-、γ2-、γ3-、β-、αs1-CN、蛋白眎、蛋白胨;β-CN被逐步水解并在24h内完全水解［18］。Urea-PAGE图能很清晰的展示纤溶酶处理的脱脂乳中β-CN的大量水解。根据SDS-PAGE电泳条带的强度发现，酶交联的β-CN在酸性条件下具有较高的稳定性，能抵抗胃蛋白酶的消化［19］。上述这些研究结果可以充分地表明电泳方法可以成功的用来分析CN的水解。然而，通过电泳分析只能定性说明胶束解离与聚集的过程。

2.2 反相高效液相色谱法(reversed－phase highperformance liquid chromatographic，RP－HPLC)

反相高效液相色谱法，一般用非极性固定相，流动相为水或缓冲液。CN在解离或聚集的过程中，通过RP-HPLC可以测得单体的含量，进行定量说明。Thoma［20］等人通过RP-HPLC方法定量的测定了CN的水解产物糖基化巨肽和非糖基化巨肽，发现此方法的准确度和精密度都很好。Aline［21］等人用RP-HPLC分离CN和它们的脱磷酸产物，通过峰的保留时间对各个单体的分离以及脱磷酸产物成功地进行了确定。

电泳和液相色谱法是测定CN胶束解离的两种常见方法，样品处理都相对简单，干扰小、进样量少、操作简单、灵敏度高，是直观测定CN胶束解离的手段，快速、准确。

2.3 超声波光谱法(ultrasonic spectroscopy)

超声波光谱法通过测定溶液的粒径来动态观察CN胶束的解离与聚集，通过测定超声速率和衰减量的变化来表征CN胶束的解离与聚集。传统的超声波有分辨率限制，超声波速率的最高分辨率是0.1m/s，不能测量凝胶过程。最新引进的高分辨率的超声波光谱能使超声速率测量有更高的分辨率，可达0.2mm/s。

用超声波光谱法可以研究酶凝、酸凝和乳清蛋白的热凝胶系统，超声波实验可以证明凝胶的出现、明确反应的不同阶段，但不能详细的说明其中细节［22］。超声波光谱可以和流变学结合使用，更加有利于对酪蛋白解离或聚集细节的研究。Wang［23］对比超声波和振荡流变学方法发现，通过超声波的方法测量CN酶法水解和聚集过程效果更为明显，但对CN凝胶的形成不敏感。通过高分辨率的超声波光谱和动态流变学、近红外透射结合分析酶凝过程中牛乳微结构的动态改变，结果发现，由于κ-CN“毛发层”水解胶束聚合成的簇，胶束的平均粒径降低然后形成凝胶结构，超声波对聚合物的散射能很好的描述酶凝过程中超声衰减的变化［24］。高分辨率的超声波光谱能低强度、无损的分析牛乳形成的凝胶微观进程的细节，必将有广阔的应用前景。

2.4 扩散波光谱(diffusing wave spectroscopy，DWS)

扩散波光谱可以检测酶凝过程中CN胶束大小的改变，以此来分析CN胶束的聚集。DWS对粒径大小的变化很敏感，能够用来检测粒径大小的变化及 CN 胶束的聚集［25］。Alexander［26］等人通过 DWS测粒径大小，粒径迅速增加能成功表征凝胶点，CN胶束半径的小幅度减小是由于κ-CN毛层的坍塌和移除。此实验可以说明DWS结果可以成功的分析CN胶束的解离与聚集。DWS还可以成功的观察酶凝过程中表观半径和浊度的变化:酶凝过程中脱脂乳的浊度和表观半径都是增加的［27］。DWS还可以用于酸奶和干酪的加工中检测CN胶束的聚集。DWS是一种较为先进的方法。

2.5 动态光散射(dynamic light scattering，DLS)

近几年光散射方法发展迅速，主要由于其对样品是非侵入性的;简便、快捷;实验成本比较低;样品不需要任何处理(除稀释之外)。光散射需样品满足“单一散射原则”，因此需要对样品进行高度稀释［28］。章宇斌［29］等人用DLS测定了胶束尺寸并研究了CN胶束在各种因素下的聚集行为，热处理导致流体力学半径(Rh)不断减小，Rh随蛋白浓度和离子强度先减小后增大。Qi［30］等人通过DLS说明蛋白酶加入后的0～120min，Rh增加;120～180min 时，Rh逐渐趋于稳定，这些结果成功表明CN加入蛋白酶后发生聚集。粒径大小或分布的改变能为胶束的聚集和解离提供有效信息，能帮助预测胶体系统的稳定性和一系列宏观性质。不同因素影响下，CN胶束会发生不同程度的解离和聚集，DLS能快速、无创的测量CN胶束的粒径。但是，通过DLS测粒度分布时，采用不同稀释剂和不同温度，粒度分布是不同的［31］。

2.6 粒度仪(Particle Size Analyser)

国外用DLS和DWS研究CN的较多，而用粒度仪测量CN胶束大小并不多见。McSweeney［32］等人通过马尔文粒度分析仪测得模拟乳化液加热之前pH在6.8时，粒径分布在 10～100μm;pH6.9 时，1～10μm;pH≥7.0，粒度分布在＜1μm，此结果可以说明调节pH可以增加CN胶束的稳定性;粒度仪能成功测量CN胶束的粒径。

粒度仪在测定CN胶束粒径方面的报道比较少，激光光散射粒度仪报道相对较多，但是其原理和光散射原理一样，这里不再介绍。光散射具有无损、无耗、快速、检测温度适宜、信息量多、操作简便快速等优点，但缺点也很明显，必须要对样品进行高度稀释，这就限制了其应用。而扩散波光谱是一种无干扰、无侵入的光散射技术，不需要对样品进行稀释，适用于稠密的未稀释样品多重散射的光测量。

紫外可见分光光度法是通过测定溶液的浊度变化说明CN胶束稳定性的。

2.7 紫外可见分光光度计(UV－visible absorption spectroscopy)

由于各种物质具有不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量也不尽相同，可根据吸收光谱判别物质是否发生聚集和解离。在600nm下，用紫外可见分光光度计(UV-可见)测CN胶束溶液的吸光度，发现10℃和30℃CN聚集方式相似，但10℃时聚集速率慢［33］。Hidalgo［34］等人用 UV-可见说明加热使κ-CN稳定性发生变化，并在聚集之前构象发生改变或局部解离。

UV-可见是研究物质的成分、结构和物质相互作用的有效手段，具有灵敏度高、分析速度快、应用广泛等特点。

3 展望

牛乳中含有丰富的蛋白质、脂肪、矿物质等营养物质，CN是乳蛋白中一大类磷蛋白，近年来许多学者对CN胶束的结构、影响因素、酸凝及酶凝机理等进行了研究，但由于其结构的复杂性，至今为止，CN胶束的内部详细结构尚不清楚，只提出了一些理论结构模型，CN胶束内部结构的研究方法和手段是今后研究的重点，有待于学者深入探究。

研究CN胶束的解离与聚集的手段中，超声波光谱和扩散波光谱更先进、无损，与传统的方法相比，超声波光谱可以低强度、无损的分析样品，能透过光学上不透明的样品，更适合牛乳系统的研究;扩散波光谱适用于研究光学不透明稠密体系中凝固(胶凝)、聚合、絮凝和聚集过程，对粒径的变化很敏感;紫外通过测溶液的浊度来分析样品，快速、简便，而前处理较其他方法比较复杂，但由于仪器的价格较其他先进仪器低廉，因此普及度高，应用广泛;超声波光谱仪和扩散波光谱仪价格昂贵，对于这两种方法研究CN胶束的稳定性在国内罕见报道，因此应用受到限制，但鉴于具有多种优点，相信在以后的研究应用中会越来越广泛。

［1］Liu Y，Guo R.Interaction between casein and sodium dodecyl sulfate［J］.Journal of Colloid and Interface Science，2007，315:685-692.

［2］Donato L，Guyomarc H F.Formation and properties of the whey protein/κ-casein complexes in heated skim milk-A review［J］.Dairy Sci Techno，2009，89:3-29.

［3］Phadungath C.Casein micelle structure:a concise review［J］.Songklanakarin J Sci Technol，2005，27(1):201-212.

［4］韩清波，刘晶.酪蛋白胶束结构及其对牛乳稳定性的影响［J］.中国乳品工业，2007，35(2):43-45.

［5］Horne D S.Casein micelle structure:Models and muddles［J］.Current Opinion in Colloid ＆ Interface Science，2006，11:148-153.

［6］Kruif C G，Huppertz T，Volker S U，et al.Casein micelles and their internal structure［J］.Advances in Colloid and Interface Science，2012:171-172.

［7］方海田，德力格尔桑，刘慧燕.牛乳中CN胶束结构理论模型的研究进展［J］.农业科学研究，2006，27(3):86-89.

［8］Dalgleish D G.Casein micelles as colloid:Structures and stabilities［J］.J Dairy Sci，1998，81:3013-3018.

［9］Dalgleish D G，Spagnuolo P A，Goff H D.A possible structure of the casein micelle based on high-resolution field-emission scanning electron microscopy［J］.International Dairy Journal，2004，14:1025-1031.

［10］Knudsen J C，Skibsted L H.High pressure effects on the structure of casein micelles in milk as studied by cryotransmission electron microscopy［J］.Food Chemistry，2010，119:202-208.

［11］Marchin S，Putaux J L，Pignon F，et al.Effects of the environmental factors on the casein micelle structure studied by cryo-transmission electron microscopy and small-angle x-ray scattering/ultrasmall-angle x-ray scattering［J］.The Journal of Chemical Physics，2007，126:1-10.

［12］McMahon D J，Oommen B S.Supramolecular structure of the casein micelle［J］.Journal of Dairy Science，2008，91:1709-1721.

［13］Thiebaud S R，Dumay M E.Pressurisation of raw skim milk and of a dispersion of hosphocaseinate at 9℃ or 20℃:effects on casein micelle size distribution［J］.International Dairy Journal，2004，14:55-68.

［14］Gebhardt R，Doste W，Friedric J，et al.Size distribution of pressure-decomposed casein micelles studied by dynamic light scattering and AFM［J］.Eur Biophys J，2006，35:503-509.

［15］张德添，何昆，张飒，等.原子力显微镜发展近况及其应用［J］.现代仪器，2002(3):6-9.

［16］Bansal N，Fox P F，Mcsweeney P L H.Factors that affect the aggregation of rennet-altered casein micelles at low temperatures［J］.International Journal of Dairy Technology，2008，61:56-61.

［17］Anema S G，Lee S K，Klostermeyer H.Effect of pH at heat treatment on the hydrolysis of k-casein and the gelation of skim milk by chymosin［J］.Food Science and Technology，2007，40:99-106.

［18］Crudden A，Bastien A D，Fox P F.Effect of hydrolysis of casein by plasmin on the heat stability of milk［J］.International Dairy Journal，2005，15:1017-1025.

［19］Monogioudi E，Faccio G，Lille M，et al.Effect of enzymatic cross-linking of β -casein on proteolysis by pepsin［J］.Food Hydrocolloids，2011，25:71-81.

［20］Thoma C，Krause I，Kulozik U.Precipitation behaviour of caseinomacropeptides and their simultaneous determination with whey proteins by RP-HPLC［J］.International Dairy Journal，2006，16:285-293.

［21］Molina A C T，Alli I，Konishi Y，et al.Effect of dephosphorylation on bovine casein［J］.Food Chemistry，2007，101:1263-1271.

［22］Corredig M，Marcela A，Dalgleish D G.The application of ultrasonic spectroscopy to the study of the gelation of milk components［J］.Food Research International，2004，37:557-565.

［23］Wang Q，Bulca S，Ulrich K.A comparison of low-intensity ultrasound and oscillating rheology toassesstherenneting properties of casein solutions after UHT heat pre-treatment［J］.International Dairy Journal，2007，17:50-58.

［24］Dwyer C，Donnelly L，Buckin V.Ultrasonic analysis of rennet-induced pre-gelation and gelation processes in milk［J］.Journal of Dairy Research，2005，72:303-310.

［25］Singh Y H H，Horne D S.Determination of early stages of rennet-induced aggregation of casein micelles by diffusing wave spectroscopy and rheological measurements［J］.Current Applied Physics，2004，4:362-365.

［26］Marcela A，Dalgleish D G.Application of transmission diffusing wave spectroscopy to the study of gelation of milk by acidification and rennet［J］.Colloids and Surfaces B:Biointerfaces，2004，38:83-90.

［27］Sandra S，Cooper C，Marcela A，et al.Coagulation properties of ultrafiltered milk retentates measured using rheology and diffusing wave spectroscopy［J］.Food Research International，2011，44:951-956.

［28］MarcelaA，Dalgleish D G.Dynamiclightscattering techniques and their applications in food science［J］.FOBI，2006，1(1):2-13.

［29］章宇斌，齐崴，苏荣欣，等.动态光散射分析不同物化条件下CN的聚集行为及其胶束尺寸［J］.分析化学，2007，35(6):809-813.

［30］Qi W，Su R X，He Z M，et al.Pepsin-induced changes in the size and molecular weight distribution of bovine casein during enzymatic hydrolysis［J］.J Dairy Sci，2007，90:5004-5011.

［31］Beliciu C M，Moraru C I.Effect of solvent and temperature on the size distribution of casein micelles measured by dynamic light scattering［J］.J Dairy Sci，2009，92:1829-1839.

［32］McSweeney S L，Mulvihill D M，O’Callaghan D M.The influence of pH on the heat-induced aggregation of model milk protein ingredient systems and model infant formula emulsions stabilized by milk protein ingredients［J］.Food Hydrocolloids，2004，18:109-125.

［33］Bansal N，Fox P F，McSweeney P L H.Aggregation of rennet-altered casein micelles at low temperatures［J］.J Agric Food Chem，2007，55:3120-3126.

［34］Hidalgoa M E，Piresb M S，Risso P H.A study on bovine kappa-casein aggregation after the enzymatic action of chymosin［J］.Colloids and Surfaces B:Biointerfaces，2010，76:556-563.