三叶因子3研究进展

周 帅，符国珍

(中南大学湘雅医学院附属海口医院暨海口市人民医院肝胆外科，海南 海口 570208)

三叶因子(Frefoil factor family，TFF)是一类含一个或两个结构域的分泌蛋白，该结构域是由六个半胱氨酸的三对二硫键形成典型的三叶状结构，因此称为三叶因子。而此特殊三叶状结构赋予了TFF家族蛋白耐酸、耐碱和耐蛋白酶水解的特性，同时也是其在胃肠道行使功能所必需的结构。目前研究表明，人类TFF包括三类：乳腺癌相关的多肽(Spasmolytic peptide-2，PS2或Trefoil factor family-l，TFF1)、解痉多肽(Spasmolytic peptide，SP或trefoil factor family-2，TFF2)和小肠三叶因子(Intestinal trefoil factor，ITF或Trefoil factor family-3，TFF3)。 其 中 TFF3 于 1991 年 由Suemori首次在大鼠空肠发现[1]。TFF3在黏膜防御、修复、再生以及免疫系统和神经系统中发挥着重要作用，并且其表达的异常与疾病的发生发展密切相关。

1 分子结构和组织分布

自Suemori等[1]于1991年发现TFF3在小鼠空肠表达以来，Chinery等[2]和Schmitt等[3]在1996年相继报道了编码TFF3的基因和其他的三叶因子家族一样位于染色体21q22.3。TFF3和TFF1一样都只含有一个环状构成三叶状结构域，但在研究TFF3三级结构中发现，其表面(第2、3个环之间)存在一个疏水的口袋状的结构[4]，而此结构可能就是其与其他蛋白作用的结合位点。TFF3蛋白的等电点是4.75[5]。在体内，TFF3以单聚体或者同源二聚体的形式与其他蛋白质构成化合物而发挥作用。进一步研究发现，TFF3二聚体的三叶状结构域的N端有一个螺旋状结构突出于核心基团之外，并且其结构并不像TFF1二聚体是由两个疏松的单聚体构成，而是由单聚体中的两个二硫键相链接，构成紧密的结构[5]。但是有关TFF3二聚体生物与单聚体的活性，目前相关研究存在不同的结果[5-6]。

TFF3在生理状态下，主要表达于消化道黏膜及其他黏膜中的杯状细胞。Xian等[7]研究发现，TFF3的表达水平随着小肠杯状细胞数量的增多而上升。Kouznetsova等[8]利用 rt-PCR、Western blot等对胃不同部位的黏膜表达TFF3经行了分析，发现胃体的泌酸腺体黏膜表达很少的TFF3，但在胃体、胃窦移行区有大量TFF3的表达，在幽门区以及十二指肠近段有TFF3分泌。Madsen等[9]对体内多种组织TFFS的表达情况研究发现，TFF主要分布于胃肠道，在生理情况下，TFF1主要分布于胃和结肠，TFF2主要分布在胃。TFF3主要分布在结肠，但在很多组织的黏膜表面都可检测到。

2 生理功能及其作用机制

胃肠道黏膜屏障是维护人体健康的重要因素。肠黏膜屏障损伤的机制包括肠黏膜缺血、缺氧及氧自由基的损伤、细胞因子的损伤、肠道免疫功能受损和细胞凋亡。TFF3在胃肠黏膜机械屏障、生物屏障、化学屏障和免疫屏障等扮演着不同的角色。

2.1 黏膜修复和保护作用 肠黏膜屏障中的杯状细胞分泌蛋白是肠黏膜的重要组成部分，也是肠道抵御疾病的重要物理屏障。Chen等[10]利用Western blot和免疫沉淀法分析了TFF3、IgGFcγBP和Muc2在肠黏膜疏松层和致密层黏液存在方式，发现这三种肠黏膜分泌的蛋白在肠黏膜中相互链接，在黏膜中构成网络状结构，从而保护肠黏膜免受胃酸等有害因素的损害。

2.2 抑制黏膜细胞的凋亡 胃肠道黏膜上皮细胞是抵御有害因素的重要屏障，在免疫、炎症、肿瘤的形成等病理生理过程中NF-κB起着抑制细胞凋亡的作用，从而保护胃肠道黏膜免受外界有害因素的损害。Chen等[10]利用大鼠ICE-18细胞作为研究模型，利用NF-κB阻断剂研究TFF3对小肠上皮细胞的效应，研究结果表明：①TFF是胃肠道分泌的内源性多肽；②在小肠上皮细胞中，TFF3能促进NF-κB的活性，从而增强ICE-18细胞的抗凋亡能力；③TFF3对小肠上皮细胞的抗凋亡效应是通过NF-κB相关的细胞信号瀑布效应来调节的。但是Loncar等[11]研究缺发现NF-κB和TNF均会导致小肠黏膜TFF3表达的降低，但这种效应能被IκB(NF-κB抑制剂)所抑制。另有研究表明NF-κB转录因子亚单位的结合位点在TFF3的5’端区域[12]。但是具体的调节方式以及调控的相关机制有待进一步研究。而PI3-K/Akt途径促进了TFF3和MUC2在小肠上皮细胞的表达，TFF3又能反过激活PI3-K/Akt途径，以此来下调Caspase-3/9的活性，因此TFF3在小肠黏膜的杯状细胞分化中亦扮演着重要的角色[13]。TFF3在抑制肠道黏膜凋亡、杯状细胞的分化中扮演着不同的角色，从而对黏膜起到保护作用[10]。

2.3 免疫屏障 免疫屏障在胃肠道黏膜保护中也扮演着重要作用。Cook等[14]通过研究发现，TFF3通过促进单核细胞的迁移调节免疫反应，以此发挥对黏膜的修复和保护作用。Tan等[15]发现TFF3通过上调COX-2从而促进上皮细胞分泌PGE-2和PGI-2，从而避免氧化应激对上皮细胞的损伤。从而分析认为TFF3对上皮细胞具有保护和修复作用。

2.4 肿瘤的扩散 除了研究其胃肠道黏膜保护作用，对于TFF3在肿瘤细胞扩散和入侵方面也有一些研究。上皮细胞的形态和运动方面的改变与其细胞间粘附的调节机制的关系比较密切，即E-cadherin/catenin细胞粘附复合物。研究发现转染TFF3的细胞表达E-cadherin、alpha和beta-catenin都明显减少，而且E-cadherin表达的减少与转录时的甲基化没有关系。进一步研究发现，转染hTFF3的细胞E-cadherin半衰期缩短，也就是E-cadherin加速了降解。因此TFF3在转录水平以及转录后修饰过程中对E-cadherin介导的细胞之间的粘附调节在TFF3的致病以及肿瘤扩散有重要的作用[16]。另一研究也证实了上述说法，TFF3对于黏膜的修复作用是通过下调E-cadherin、加强细胞间连接、促进细胞迁徙来实现的；此外，TFF3亦可上调上皮细胞中tightening cIaudin-l的含量、下调tighteningclcIaudin-2的表达，增强表层细胞的抵抗力、降低上皮的渗透性来达到黏膜修复的目的[17]。

3 TFF3与疾病

3.1 TFF3与炎性疾病 目前，研究发现胃肠道炎性疾病,以及肝脏疾病、胰腺炎等的病变组织中,TFF出现异常表达现象。这种异常一般表现为异位表达和/或表达量增加，其作用与黏膜修复和再生有关。非甾体抗炎药物所致的胃黏膜损伤会引起黏膜局部的微环境改变，比如上皮细胞的氧供给减少。Hernandez等[18]通过阿司匹林制造大鼠胃黏膜炎症模型，继而采用缺氧探针免疫染色、免疫组化、Western blot以及RT-PCR等方法检测大鼠胃黏膜中TFF3的含量，发现给予阿司匹林的大鼠胃黏膜中TFF3水平是正常组的1.8倍，同时缺氧的胃黏膜TFF3 mRNA的含量是正常组的9.3倍。

3.2 TFF3与肿瘤 目前对TFF3的研究更多的集中在研究其与肿瘤的发生发展相关性。Okada等[19]对小鼠肝癌模型和人的肝细胞癌组织中TFF3的表达情况研究，发现7只小鼠肝癌组织中有6只TFF3基因是高表达的，而在人肝癌组织中有40%的组织中TFF3在mRNA和蛋白水平都升高。进一步深入研究发现TFF3启动子CpG-260的甲基化水平与TFF3的高表达相关，因此推测TFF3的表达是肝癌发生发展的一个重要过程，同时启动子的甲基化可能对TFF3的表达具有调控作用，从而抑制肝癌的发展。TFF3的异常表达在甲状腺[20]、乳腺、胃、肠道22以及免疫系统[14]、中枢系统等[22]肿瘤组织和血中均有报道。但TFF3与肿瘤的具体相互作用目前报道还比较少，有待进一步研究。

4 TFF3检测与临床实验诊断

TFF3是最近十年研究较为热门的微量分泌蛋白，ELISA以及肿瘤分泌蛋白组学等都是TFF3临床实验诊断常用的成熟技术。Vestergaard等[23]设计研发了TFF3的ELISA检测方法，并进行了初步的应用尝试。在正常人群血清中TFF3的浓度为91～250 pmol/L，并且其与年龄和性别无关，初步的应用到胃肠道的相关疾病中，研究结果提示血清TFF3水平与临床病理改变之间具有相关性并且对研究胃肠道相关疾病具有长远的价值。Xue等[24]应用蛋白组学方法，通过对来自于同一病例的结肠直肠癌原发癌细胞株SW480和淋巴结转移癌细胞株SW620的比较分析，筛选出TFF3、GDP15等6个潜在的肿瘤标志物。进一步利用Western blot和大规模的血清样本队列分析，检测结果显示病例组的血清TFF3水平显著高于正常对照组，淋巴转移癌高于非淋巴转移癌。而病例资料分析表明TFF3的高水平与肿瘤的较高组织学分级及TNM分期、转移的进展程度显著相关,而与性别、年龄、肿瘤部位无显著相关性。其研究认为血清TFF3和GDP15检测可能成为结肠直肠癌鉴别，特别是癌转移监测的有较高应用价值的临床诊断试验。

总之，TFF3是重要的生物学功能调节因子，它的生理病理功能与组织再生修复、细胞迁移、增殖分化乃至肿瘤的发生发展等功能密切相关，这也使其可能作为炎症发生的调节因子、抑癌基因或癌基因来参与肿瘤的发生和发展。不容置疑的是，大量研究成果所揭示出的其在病理研究中的表现与病理改变之间的相关性，引起了学者们对于TFF3是否可以成为一个新的生物学标志物的研究兴趣。对于TFF3是否能应用于临床诊断,还需要更多的、多中心的、特别是前瞻性的研究资料来加以判断，这也是学者们共同强调的观点。可以相信，随着对TFF3生物学功能研究的不断深入，特别是在肿瘤复发、肿瘤转移的监测及疗效观测等方面的研究，TFF3在相关疾病的临床诊断的潜在价值将会得到进一步的挖掘和展现。

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