霍乱弧菌快速检测法研究概况

郭 红

(天津市宁河县中医院，天津301500)

1 细胞学方法

1.1 高速离心培养法:传统的常规离心培养法检测霍乱弧菌的特异性和灵敏程度均较高，但是需要的时间较长，初步得到报告的时间至少在30 h以上。另外，若标本中霍乱弧菌的数量少，其检验结果长呈现阴性，给实际工作增添了一定的难度。黄红莹等［4］在传统的分离方法基础上通过高速离心技术使标本中霍乱弧菌的数量相对的增加，以达到快速检测的目的。该方法采用高速离心(6 000 r/min)取其沉淀物接种普通琼脂平板37℃培养，一般菌落出现时间在8 h左右，使检出的阳性结果能在10 h内发出报告，比常规检测方法快，而阳性检出率也有较大程度的提高。

1.2 免疫学方法

1.2.1 血清学方法:免疫学方法普遍认为特异性强、灵敏度高、易于观察、应用范围广。血清学方法是最基本的免疫学方法，主要用于细菌的分型。目前，根据菌体抗原的不同，将霍乱弧菌分为200多个血清群［5］，只有O1群的古典生物型、埃尔托生物群和O139群能引起大流行。正确的血清分型可为流行病学调查、诊断及临床用药提供科学的依据。但此方法就目前所分离出的血清群认为有局限性，若出现新的血清型时以现在仅有的血清检测易出现漏检。

1.2.2 改良免疫荧光菌球法:改良免疫荧光菌球法［6－7］是在免疫荧光菌球法的基础上秉承其敏感性高、抗干扰能力强的优点，还可同时检测外环境水体和水产品中的O1和O139霍乱弧菌，可避免常规法对检测O139霍乱弧菌(特别是产毒株)的漏检，是目前霍乱外环境监测的首选方法之一。但要求样品中菌浓度在9 cfu/mL以上，若标本中霍乱弧菌量少时常呈阴性检测结果，因此需要增菌培养6～8 h后在镜检，操作较为繁琐，试验结果又不稳定。

1.2.3 胶体金免疫层析法:胶体金免疫层析法特异性高，灵敏度好，不仅能检测活菌，还能检测死菌。谢昭聪等［7］用此方法对水产品中的霍乱弧菌的快速检测进行了研究。应用该方法进行检测，阴性者可直接报告，阳性者则参照《霍乱防治手册》进一步分离鉴定，因为目前我国对霍乱弧菌的胶体金免疫层析法还没有具体的标准，仍以细菌培养法为核心，结合标准血清凝集试验鉴定出抗原为依据。该法假阳性率较高(8%)只能作为初筛试验。

1.2.4 霍乱弧菌快速检测试纸条:O139霍乱弧菌快速检测试纸条是结合特异性单克隆抗体技术和免疫胶体金技术研制出的一种新方法。邓志红等［2］为该试纸条的临床效果作了评价。其检测十分简捷，5～10 min内即出结果，结果清晰容易判定，灵敏度高，特异性强，并且不需要任何设备，没有特殊的实验室条件要求，适合基层医疗机构腹泻门诊病人的O139霍乱监测。但该方法阳性预测值低(46.67%)，不能取代常规细菌培养，只能作为一种筛检方法使用，最终的确诊仍以细菌培养结果为准。

2 分子生物学方法

2.1 脉冲场电泳:脉冲场电泳是近几年发展起来的分子生物学技术，这一技术可将50 Kb以上或几千Kb的DNA大片段进行有效的分离，解决了一般琼脂糖电泳不能实现的技术难点。该法可将大片的DNA采用内切酶切割进行有效的分离，不同来源的菌株可产生不同的电泳图谱，进而对霍乱弧菌不同血清型之间的基因组差异进行分析，这一技术近年来在霍乱分子流行病学研究中已得到应用。丁建清等［8］应用此技术对从霍乱患者和外环境水体中分离出的20株霍乱弧菌进行了基因分型，显示菌株之间其脉冲场电泳图谱有较大差异，基因片段位置及大小也不等，提示存在多态性。

2.2 PCR方法PCR受试剂盒、设备、试剂等条件的限制，基层单位很难展开，现仅对普通一对引物PCR、多重PCR做一简单介绍。

2.2.1 普通一对引物PCR该法只设计一对特异引物。丁建清等［9］根据Bisweswar报道的霍乱弧菌编码外膜蛋白ompw基因合成一对外膜蛋白引物，采用PCR法对天津市海河水系非O1群霍乱弧菌感染状况进行了检测。102份水样PCR检测总阳性率为52%，扩增片段588bp，与常规分离培养比较，符合率为100%。霍乱弧菌外膜蛋白引物快速检测海河水系非O1群霍乱弧菌敏感性高，特异性强，可提高检测速度四五倍，为非O1群霍乱的防治提供了一种有用的检测手段。

2.2.2 多重PCR:多重PCR是同时用一种以上引物对在同一反应管中同时扩增出多条目的DNA片段，简捷，快速，灵敏，特异性高。井良义等［10］将针对霍乱弧菌肠毒素A亚单位基因(ctxA)、小带联结毒素基因(zot)、辅助霍乱弧菌肠毒素基因(ace)、霍乱弧菌毒素共调菌毛A基因(tcpA)、毒素表达调控蛋白基因(toxR)的5对特异引物进行多重PCR，可快速、敏感地检测霍乱弧菌O1群、O139、非O1群/非O139群的毒素相关基因。井良义等［11］将对ctxA、RTX毒素家族的细胞毒素基因(rtxA)和毒素激活基因(rtxC)的3对引物进行多重PCR，可快速、敏感地检测霍乱弧菌RTX毒力基因。金慧英等［12］建立了同时检测肠出血性大肠埃希菌(O157:H7)和霍乱弧菌的多重PCR方法，首先选择O157:H7的O抗原(rfbE)、H抗原(fliC)基因以及霍乱弧菌外膜蛋白(ompw)基因和ctxA特异的4对引物，共同对O157:H7和霍乱弧菌进行PCR扩增，并以琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，可出现4单一条带。该方法可对O157:H7和霍乱弧菌进行同时检测。芮勇宇等［13］分别针对ctxA、O139群基因和tcpA设计引物，建立了可检测和区分霍乱弧菌O1群古典型、埃尔托型、O139群和非O1、非O139群的多基因PCR方法。许龙岩等［14］以霍乱弧菌O139特异基因(T139)、ctxA、tcpA、副溶血性弧菌热稳定性直接溶血素基因(tdh)为靶序列，建立了可同时检测食品中O1群、O139群霍乱弧菌和副溶血性弧菌的多重PCR方法。该方法整个过程7～10小时完成，是一种敏感、省时、省力的检测方法。

PCR虽然有极高灵敏度，也有很强的特异性，而且快速方便，但成本高，容易出现假阳性，且需要PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等，它的广泛使用受到一定的限制［15］。

随着现代分子生物学理论与技术的发展以及新仪器的研发，霍乱弧菌的检测方法必将向快速、准确、灵敏的方向发展，大大提高检验检疫和临床诊断的检测质量和效率。

［1］ 李丽娟，霍乱弧菌的检测研究进展［J］.实用医技杂志，2007，11(4):523 －525.

［2］ 邓志红，胡世雄，曾亚雄，等.O139霍乱弧菌快速检测试纸条临床效果评价［J］.实用预防医学，2007，11，(5):973－974.

［3］ 李士红.对1例非典型霍乱患者病原菌的实验鉴定［J］.中国检验医学与临床，2008，6(1):74.

［4］ 黄红莹，许国强，霍乱弧菌快速检测法探讨［J］.河南大学学报(医学版)，2007，23(4):22.

［5］ 丁静秋，刘延清，陈亢川，等.霍乱防治手册［M］.5版，北京:中华人民共和国卫生部疾病控制司，2008:35.

［6］ 许学斌，顾宝柯，胡培，等.改良免疫荧光菌球法检测外环境中O1和O139群霍乱弧菌效果的探讨［J］.中国预防医学杂志，2008，4(3):204 －206.

［7］ 谢邵聪，宋志强，吕敬章，等.应用胶体金免疫层析法检测水产品中霍乱弧菌的研究［J］.中国国境卫生检疫杂志，2008，28(3):163－165.

［8］ 丁建清，董杰，王书梅，等.脉冲场电泳在霍乱弧菌分型中的应用［J］.中国卫生检验杂志，2005，15(7):790－791.

［9］ 丁建清，王书梅，田勇琴，等.PCR快速测定法在检测海河水体非O1群霍乱弧菌中的应用［J］.环境与健康杂志，2007，19(6):438－440.

［10］ 井良义，陈锦英，王书梅，等.多重PCR检测霍乱弧菌的毒素相关基因［J］.环境与健康杂志，2007，20(6):361－371.

［11］ 井良义，陈锦英，王书梅，等.多重PCR检测霍乱弧菌RTX毒力基因［J］.中国卫生检验杂志，2007，15(9):1039－1041.

［12］ 金慧英，陈华标，陶开华，等.肠出血性大肠埃希氏菌 O157:H7和霍乱弧菌的多重PCR检测［J］.解放军预防医学杂志，2008，21(4):252 －255.

［13］ 芮勇宇，蔡初的，萧斌权，等.勇多基因PCR检测和区分不同群型霍乱病原菌［J］.中国预防医学杂志，2007，34(5):278－280.

［14］ 许龙岩，周宏斌，高东微，等.MPCR检测食品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌的研究［J］.卫生研究，2007，34(1):115－117.

［15］ 王艳玲，霍乱弧菌快速检测法研究进展［J］.职业与健康，2007，23(18):1656 －1657.